圈养非人灵长类优势乳酸杆菌的分离筛选和功能验证
本文从南京红山动物园圈养非灵长类动物的粪便中分离得到了16株乳酸杆菌，通过对其耐酸耐胆盐性能的分析，发现有三株菌Lac5-2、Lac5-4、Lac6-2耐酸耐胆盐性能较好（Lac5-2、Lac5-4从白眉长臂猿中获得，Lac6-2从松鼠猴中得到），在PH3和胆盐浓度0.5%时测得三株菌OD值均稳定在1左右，且随着PH值的下降和胆盐浓度的升高，三株菌的活菌数下降较慢，Lac6-2在适宜的酸性条件下可刺激其进一步生长。之后对7株比较耐受酸盐的菌株进行药敏试验发现其无耐药性，可能是因为红山动物园的抗生素使用较为规范。进一步对这三株菌进行IPEC-J2（intestinal porcine epithelial cell-J2）细胞的黏附试验和对大肠杆菌菌株E.coli ETEC K88（Enterotoxigenic Escherichia coli K88）的抑菌试验，发现有一株从松鼠猴分离的菌株Lac6-2黏附性较好，在乳酸杆菌菌量与细胞量比值为100:1时黏附率为16.2%，在乳酸菌菌量与大肠杆菌菌量比为10:1时黏附抑制率高达85.5%，将该株作为本次筛选试验的最终优势菌株，作为下一步肠道体外模型筛选的基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 主要仪器和设备2
1.1.2 主要试剂2
1.1.3 细胞和菌株3
1.2 方法 3
1.2.1 乳酸杆菌的分离3
1.2.2 耐酸耐胆盐性筛选3
1.2.3药敏试验3
1.2.4 OD值与CFU之间的对应关系3
1.2.5 细胞黏附试验4
1.2.6 细胞黏附抑制试验4
1.2.7 数据统计4
2 结果与分析5
2.1 命名和分离5
2.2耐酸耐胆盐试验结果5
2.3 药敏试验结果6
2.4 0D值与CFU对应关系结果6
2.5黏附试验结果7
2.6 黏附抑制试验结果7
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
2.7 16S rDNA测序鉴定结果8
3 讨论9
4 小结10
致谢10
参考文献10
圈养非人灵长类优势乳酸杆菌的分离筛选和功能验证
引言
鉴于上述背景，本研究旨在从圈养的非人灵长类动物粪便中分离乳酸杆菌，通过体外试验筛选出符合肠道微环境和具有较强抑菌能力的菌株，为开发相关功能性产品打下基础。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 主要仪器和设备
细菌培养箱
上海恒科技有限公司
PCR仪
宝生物工程（大连）有限公司
超声破碎仪
中国赛飞有限公司
微型振荡器
江苏金怡仪器科技有限公司
全自动恒温水浴培养箱
江苏省无锡科隆实验仪器公司
数字分析天平
德国Sartorius集团
4℃高速小型离心机
德国Eppendorf仪器制造公司
全自动超净工作台
江苏苏净有限公司
低温摇床
恒温摇床
常州开元实验仪器有限公司
常州开元实验仪器有限公司
生物显微镜
上海普赫光电科技有限公司
紫外分光光度计
赛默飞世尔科技有限公司
酶标仪
上海闪普生物科技有限公司
1．1．2 主要试剂
酵母提取物
上海拜力生物科技有限公司
蛋白胨
北京奥博星生物技术有限责任公司
磷酸氢二钾
西陇化工股份有限公司
柠檬酸氢二铵
国药集团化学试剂有限公司
硫酸锰
西陇化工股份有限公司
硫酸镁
上海统亚化工科技发展有限公司
葡萄糖
国药集团化学试剂有限公司
乙酸钠
国药集团化学试剂有限公司
牛肉膏
国药集团化学试剂有限公司
Tween80
国药集团化学试剂有限公司
琼脂粉
北京索莱宝科技有限公司
氯化钾
国药集团化学试剂有限公司
氯化钠
西陇科学股份有限公司
磷酸二氢钾
汕头市西陇化工厂有限公司
胰蛋白胨
上海拜力生物科技有限公司
MRS培养基：蛋白胨10g，吐温801ml,牛肉膏10g，葡萄糖20g，乙酸钠5g,硫酸锰0.25g，硫酸镁0.58g，磷酸氢二钾0.2g,柠檬酸氢二铵2g，酵母提取物5g加水至800ml搅拌均匀使用蒸馏水定容至1L,并调节pH为6.26.4。配置固体培养基则按照15%/L的比例添加，在121℃高压灭菌20min待用。
LB（LuriaBertani）培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物10g，氯化钠10g，加水至800ml搅拌均匀使用蒸馏水定容至1L。配置固体培养基则按照15%/L的比例添加，在121℃高压灭菌20min待用。
PBS高压灭菌溶液：氯化钠8g，氯化钾0.2g，十二水合磷酸氢二钠3.5g，；磷酸二氢钾0.2g加1L水混匀，，在121℃高压灭菌20min待用。
1．1．3 细胞和菌株
IPECJ2细胞由江苏省农科院惠赠，大肠杆菌E.coli ETEC K88本实验室原有，样本取自红山动物园一四馆的猴子粪便。
1．2 方法
1．2．1 乳酸杆菌的分离与鉴定
选取红山动物园来自猴子园区一四馆的共13只猴子作为样本，依次是阿拉伯狒狒、山魈2只、黑帽悬猴、白眉长臂猿、松鼠猴、环尾狐猴2只，红猩猩3只、黑猩猩2只，每只猴子采取24个粪便样本依次做好标记装入无菌采样袋内快速送回学校实验室进行处理。分离所有的样品，筛选纯化其中含有的乳酸杆菌。将每个粪便样本用EP管称取0.2g，用1mL水稀释并混匀，静置数分钟待粪便自然沉降后取100uL上清液进行梯度稀释，即取7个空EP管，每管加入900uLMRS液体培养基，将100uL上清液加入第一个EP管，用涡旋机混匀再从其中取100uL到第二个EP管，以此类推，得到7个稀释梯度，取104、105、106和107四个浓度的稀释液各100uL在MRS固体培养基上用滚珠均匀涂布，每个稀释度涂三个平板，放置在37℃的烘箱中培养48小时后观察各个平皿上菌株生长情况，筛选出白色针尖大小边缘光滑的乳白色可疑菌落接种于5mL液体培养基，进行纯化扩增培养，培养16小时后用接种环三区划线于平板上再次生长48小时接种于液体培养基进行纯培养，2轮过后确保分离出纯的乳酸杆菌并做好标记。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 主要仪器和设备2
1.1.2 主要试剂2
1.1.3 细胞和菌株3
1.2 方法 3
1.2.1 乳酸杆菌的分离3
1.2.2 耐酸耐胆盐性筛选3
1.2.3药敏试验3
1.2.4 OD值与CFU之间的对应关系3
1.2.5 细胞黏附试验4
1.2.6 细胞黏附抑制试验4
1.2.7 数据统计4
2 结果与分析5
2.1 命名和分离5
2.2耐酸耐胆盐试验结果5
2.3 药敏试验结果6
2.4 0D值与CFU对应关系结果6
2.5黏附试验结果7
2.6 黏附抑制试验结果7
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
2.7 16S rDNA测序鉴定结果8
3 讨论9
4 小结10
致谢10
参考文献10
圈养非人灵长类优势乳酸杆菌的分离筛选和功能验证
引言
鉴于上述背景，本研究旨在从圈养的非人灵长类动物粪便中分离乳酸杆菌，通过体外试验筛选出符合肠道微环境和具有较强抑菌能力的菌株，为开发相关功能性产品打下基础。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 主要仪器和设备
细菌培养箱
上海恒科技有限公司
PCR仪
宝生物工程（大连）有限公司
超声破碎仪
中国赛飞有限公司
微型振荡器
江苏金怡仪器科技有限公司
全自动恒温水浴培养箱
江苏省无锡科隆实验仪器公司
数字分析天平
德国Sartorius集团
4℃高速小型离心机
德国Eppendorf仪器制造公司
全自动超净工作台
江苏苏净有限公司
低温摇床
恒温摇床
常州开元实验仪器有限公司
常州开元实验仪器有限公司
生物显微镜
上海普赫光电科技有限公司
紫外分光光度计
赛默飞世尔科技有限公司
酶标仪
上海闪普生物科技有限公司
1．1．2 主要试剂
酵母提取物
上海拜力生物科技有限公司
蛋白胨
北京奥博星生物技术有限责任公司
磷酸氢二钾
西陇化工股份有限公司
柠檬酸氢二铵
国药集团化学试剂有限公司
硫酸锰
西陇化工股份有限公司
硫酸镁
上海统亚化工科技发展有限公司
葡萄糖
国药集团化学试剂有限公司
乙酸钠
国药集团化学试剂有限公司
牛肉膏
国药集团化学试剂有限公司
Tween80
国药集团化学试剂有限公司
琼脂粉
北京索莱宝科技有限公司
氯化钾
国药集团化学试剂有限公司
氯化钠
西陇科学股份有限公司
磷酸二氢钾
汕头市西陇化工厂有限公司
胰蛋白胨
上海拜力生物科技有限公司
MRS培养基：蛋白胨10g，吐温801ml,牛肉膏10g，葡萄糖20g，乙酸钠5g,硫酸锰0.25g，硫酸镁0.58g，磷酸氢二钾0.2g,柠檬酸氢二铵2g，酵母提取物5g加水至800ml搅拌均匀使用蒸馏水定容至1L,并调节pH为6.26.4。配置固体培养基则按照15%/L的比例添加，在121℃高压灭菌20min待用。
LB（LuriaBertani）培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物10g，氯化钠10g，加水至800ml搅拌均匀使用蒸馏水定容至1L。配置固体培养基则按照15%/L的比例添加，在121℃高压灭菌20min待用。
PBS高压灭菌溶液：氯化钠8g，氯化钾0.2g，十二水合磷酸氢二钠3.5g，；磷酸二氢钾0.2g加1L水混匀，，在121℃高压灭菌20min待用。
1．1．3 细胞和菌株
IPECJ2细胞由江苏省农科院惠赠，大肠杆菌E.coli ETEC K88本实验室原有，样本取自红山动物园一四馆的猴子粪便。
1．2 方法
1．2．1 乳酸杆菌的分离与鉴定
选取红山动物园来自猴子园区一四馆的共13只猴子作为样本，依次是阿拉伯狒狒、山魈2只、黑帽悬猴、白眉长臂猿、松鼠猴、环尾狐猴2只，红猩猩3只、黑猩猩2只，每只猴子采取24个粪便样本依次做好标记装入无菌采样袋内快速送回学校实验室进行处理。分离所有的样品，筛选纯化其中含有的乳酸杆菌。将每个粪便样本用EP管称取0.2g，用1mL水稀释并混匀，静置数分钟待粪便自然沉降后取100uL上清液进行梯度稀释，即取7个空EP管，每管加入900uLMRS液体培养基，将100uL上清液加入第一个EP管，用涡旋机混匀再从其中取100uL到第二个EP管，以此类推，得到7个稀释梯度，取104、105、106和107四个浓度的稀释液各100uL在MRS固体培养基上用滚珠均匀涂布，每个稀释度涂三个平板，放置在37℃的烘箱中培养48小时后观察各个平皿上菌株生长情况，筛选出白色针尖大小边缘光滑的乳白色可疑菌落接种于5mL液体培养基，进行纯化扩增培养，培养16小时后用接种环三区划线于平板上再次生长48小时接种于液体培养基进行纯培养，2轮过后确保分离出纯的乳酸杆菌并做好标记。
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