泰州地区猪场产气荚膜梭菌的分离鉴定及耐药性分析
为调查规模化猪场产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）的分布现状，判断规模化猪场中产气荚膜梭菌的毒素类型，分析其体外药敏特性。2015年从江苏泰州地区规模化养猪场采集粪便样品，经过热处理后分离培养得到193株芽孢杆菌。通过观察细菌形态学与生长特性、生化试验、多重PCR基因分型和毒素致死试验，鉴定出产气荚膜梭菌，并对其进行体外药敏试验。结果中将所分离的193株革兰阳性芽孢杆菌分为5类，其中II型菌株产生灰色圆形、光滑、边缘整齐、中等大小的菌落并在血平板上出现“双重溶血”现象，镜检可观察到位于菌体中央或近端的芽孢。按照分类随机挑选15株受试菌株通过多重PCR方法检测到C型产气荚膜梭菌1株，D型产气荚膜梭菌3株，4株细菌毒素致死试验均可引起试验小鼠死亡。致死性最强的D型产气荚膜梭菌药敏试验结果表明，该菌株对青霉素等不耐酶的β-内酰胺类抗生素耐药，对红霉素、环丙沙星等广谱抗生素中度敏感，可作为有效的治疗药物。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 样品采集2
1.1.2 培养基2
1.1.3 主要试剂2
1.1.4 主要仪器设备2
1.1.5 实验动物2
1.2 方法 2
1.2.1 细菌的分离培养2
1.2.2 细菌形态学与生长特性3
1.2.3 生化鉴定3
1.2.4 多重PCR基因分型3
1.2.5 毒素致死试验3
1.2.6 药敏试验4
2 结果与分析4
2.1 细菌的分离鉴定4
2.1.1 菌落形态与特性4
2.1.2 染色镜检结果6
2.2 生化试验结果7
2.3 细菌基因分型8
2.4 毒素致死试验8
2.5 药敏试验8
3 讨论 9
致谢9
参考文献10
江苏泰州地区猪 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
产气荚膜梭菌的分离鉴定及耐药性分析
引言
近年来，有关产气荚膜梭菌感染中大猪的报道越来越多，而且呈现出急性死亡的情况。临床表现为怀孕母猪胀气，流产，甚至死亡；健康猪群突然发病，出现狂躁不安、全身肌肉震颤和口吐白沫等症状，随后约1~2 h死亡；有的猪晚上精神状态良好，食欲正常，第2天发现死于栏中，而且多为膘情较好的猪；耐过猪群食欲下降，其生长速度和饲料利用率显著降低；在批量牲畜长途运输时,也常暴发产气荚膜梭状芽孢杆菌病。该病一旦流行导致大批动物死亡。在规模化、集约化畜牧生产的今天，该病流行并有逐年扩大之势，给养猪业造成了较大的经济损失。此外，产气荚膜梭菌还可以导致各种动物坏死性肠炎、肠毒血症，也可导致动物突然死亡，死亡率可高达70%～100%，危害严重。同时，本菌还是引起人类食物中毒和创伤性气性坏疽的主要病原菌之一，病死率高达40%～100%[1]。
产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）旧名魏氏梭菌（Clostridium welchii）或产气荚膜杆菌（Bacillus perfringens），是一种革兰氏阳性、无鞭毛、不运动的厌氧大杆菌，对厌氧程度的要求并不严。多数菌株可形成荚膜，芽孢大而卵圆，位于菌体中央或近端，形成芽孢后对外界抵抗力强。该菌是人类、家畜和野生动物共患的病原，在自然界分布极广，可见于土壤、污水、饲料、食物、粪便及人畜的肠道中。在一定条件下，可引起多种严重疾病[2]。该菌至少已发现15种毒素，能对人和多种动物致病，其中α、β、ε、ι等是主要致死毒素。根据菌株产生的4种主要毒素可将产气荚膜梭菌分为A、B、C、D、E 5个型[3]。A型菌株产生α毒素；B型菌株产生α毒素、β毒素和ε毒素；C型菌株产生α毒素和β毒素；D型菌株产生α毒素和ε毒素；E型菌株也产生α毒素和ι毒素。此外，A型、C型和D型的某些菌株可产生肠毒素（CPE）[45]。一般认为，C型菌株是导致2周龄内仔猪下痢和红痢的主要病原。A型菌株与哺乳及育肥猪肠道疾病有关，导致轻度的坏死性肠炎与绒毛退化，同时也是仔猪梭菌性肠炎的主要病因[6]。
传统的产气荚膜梭菌诊断方法是用小鼠进行毒素中和试验[7]，此试验需要标准抗毒血清和大量的实验动物，既耗时又不经济。因此，建立一种快速、简便、敏感、特异的鉴别诊断方法，对于本病的诊断、预防、治疗及流行病学调查等具有重要的现实意义。本实验以α毒素、β毒素、ε毒素、ι毒素为检测对象，建立该菌毒素基因的多重PCR检测方法[8]，对江苏泰州地区规模化养猪场所采集粪便样品的检测，调查本地区规模化猪场产气荚膜梭菌的流行情况和基因分型，为本病的鉴别诊断提供检测依据，也为当地产气荚膜梭菌病的防控提供技术支撑。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 样品采集 在江苏泰州地区规模化猪场用无菌塑料纸采集健康猪群30～60min内的新鲜粪样，立即放入冰盒中送回实验室。
1．1．2 培养基 LB液体培养基：分别称取10g蛋白胨（tryptone），5g酵母粉提取物（yeast extract），10gNaCl，加蒸馏水定容至1000mL，用1M NaOH值调pH节7.3，分装后置于121℃高压锅中灭菌约20min，冷却后于4℃保存备用。
70mm血平板培养基（郑州人福博赛生物技术有限责任公司）
1．1．3 主要试剂 革兰氏染液；细菌微量生化反应管及药敏纸片（杭州天和微生物试剂有限公司）；DL2000 DNA Marker、LA Taq酶、2×GC BufferⅠ、dNTP mixture 均为大连TaKaRa公司产品；琼脂糖（北京鼎国生物技术公司）；溴化乙锭；其余均为国产分析纯试剂。
1．1．4 主要仪器设备 电子天平；蒸汽高压锅；涡旋快速混匀器；LX100手掌型离心机（江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；隔水式恒温培养箱（上海索普仪器有限公司）；恒温培养摇床（太仓华利达实验设备公司）；电热恒温水槽（上海一恒科技有限公司）；无菌操作台（苏净集团安泰公司）；移液器（德国eppendorf公司）；Centrifuge5804R型台式高速冷冻离心机（德国eppendorf公司）；PCR仪（日本TaKaRa公司）；凝胶成像系统（中国Tanon公司）；水平电泳槽（中国Tanon公司）
1．1．5 实验动物 C57/B小鼠（实验室自繁自养）
1．2 方法
1．2．1 细菌的分离培养
1．2．1.1 样品处理 无菌操作下分别称取5g采集的样品，加入100mL带玻璃珠的三角瓶中，加入45mL灭菌生理盐水，在摇床上37℃、200r/min充分匀质30min。然后80℃水浴20min，以杀灭不耐热的细菌。将经过热处理的混悬液移取1mL置9mL LB液体培养基中，混合均匀后置于摇床上37℃、200r/min培养24h。
1．2．1.2 分离培养 取LB液体培养基中的增菌培养物在血平板培养基上划线培养[9]。画线培养时先从增菌培养物中取少量材料涂布于培养基边缘，然后将接种环上多余的材料在火焰中烧毁，待接种环冷却后，再与所涂材料的地方轻轻接触，开始画线。画线时接种环应和平皿内琼脂平行，避免划破培养基。且画线不易过密，以免形成菌苔。接种完毕，做好标记，倒扣平皿37℃培养24h。
1．2．1.3 增菌培养及保存 挑选出血平板培养基上有溶血特征的单菌落，作为疑似有致病能力的受试菌株。挑取受试菌株接种于5mL LB液体培养基，37℃、200r/min恒温摇床培养24h，待培养基变混浊，取部分菌液加30％的甘油于70℃保存备用。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 样品采集2
1.1.2 培养基2
1.1.3 主要试剂2
1.1.4 主要仪器设备2
1.1.5 实验动物2
1.2 方法 2
1.2.1 细菌的分离培养2
1.2.2 细菌形态学与生长特性3
1.2.3 生化鉴定3
1.2.4 多重PCR基因分型3
1.2.5 毒素致死试验3
1.2.6 药敏试验4
2 结果与分析4
2.1 细菌的分离鉴定4
2.1.1 菌落形态与特性4
2.1.2 染色镜检结果6
2.2 生化试验结果7
2.3 细菌基因分型8
2.4 毒素致死试验8
2.5 药敏试验8
3 讨论 9
致谢9
参考文献10
江苏泰州地区猪 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
产气荚膜梭菌的分离鉴定及耐药性分析
引言
近年来，有关产气荚膜梭菌感染中大猪的报道越来越多，而且呈现出急性死亡的情况。临床表现为怀孕母猪胀气，流产，甚至死亡；健康猪群突然发病，出现狂躁不安、全身肌肉震颤和口吐白沫等症状，随后约1~2 h死亡；有的猪晚上精神状态良好，食欲正常，第2天发现死于栏中，而且多为膘情较好的猪；耐过猪群食欲下降，其生长速度和饲料利用率显著降低；在批量牲畜长途运输时,也常暴发产气荚膜梭状芽孢杆菌病。该病一旦流行导致大批动物死亡。在规模化、集约化畜牧生产的今天，该病流行并有逐年扩大之势，给养猪业造成了较大的经济损失。此外，产气荚膜梭菌还可以导致各种动物坏死性肠炎、肠毒血症，也可导致动物突然死亡，死亡率可高达70%～100%，危害严重。同时，本菌还是引起人类食物中毒和创伤性气性坏疽的主要病原菌之一，病死率高达40%～100%[1]。
产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）旧名魏氏梭菌（Clostridium welchii）或产气荚膜杆菌（Bacillus perfringens），是一种革兰氏阳性、无鞭毛、不运动的厌氧大杆菌，对厌氧程度的要求并不严。多数菌株可形成荚膜，芽孢大而卵圆，位于菌体中央或近端，形成芽孢后对外界抵抗力强。该菌是人类、家畜和野生动物共患的病原，在自然界分布极广，可见于土壤、污水、饲料、食物、粪便及人畜的肠道中。在一定条件下，可引起多种严重疾病[2]。该菌至少已发现15种毒素，能对人和多种动物致病，其中α、β、ε、ι等是主要致死毒素。根据菌株产生的4种主要毒素可将产气荚膜梭菌分为A、B、C、D、E 5个型[3]。A型菌株产生α毒素；B型菌株产生α毒素、β毒素和ε毒素；C型菌株产生α毒素和β毒素；D型菌株产生α毒素和ε毒素；E型菌株也产生α毒素和ι毒素。此外，A型、C型和D型的某些菌株可产生肠毒素（CPE）[45]。一般认为，C型菌株是导致2周龄内仔猪下痢和红痢的主要病原。A型菌株与哺乳及育肥猪肠道疾病有关，导致轻度的坏死性肠炎与绒毛退化，同时也是仔猪梭菌性肠炎的主要病因[6]。
传统的产气荚膜梭菌诊断方法是用小鼠进行毒素中和试验[7]，此试验需要标准抗毒血清和大量的实验动物，既耗时又不经济。因此，建立一种快速、简便、敏感、特异的鉴别诊断方法，对于本病的诊断、预防、治疗及流行病学调查等具有重要的现实意义。本实验以α毒素、β毒素、ε毒素、ι毒素为检测对象，建立该菌毒素基因的多重PCR检测方法[8]，对江苏泰州地区规模化养猪场所采集粪便样品的检测，调查本地区规模化猪场产气荚膜梭菌的流行情况和基因分型，为本病的鉴别诊断提供检测依据，也为当地产气荚膜梭菌病的防控提供技术支撑。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 样品采集 在江苏泰州地区规模化猪场用无菌塑料纸采集健康猪群30～60min内的新鲜粪样，立即放入冰盒中送回实验室。
1．1．2 培养基 LB液体培养基：分别称取10g蛋白胨（tryptone），5g酵母粉提取物（yeast extract），10gNaCl，加蒸馏水定容至1000mL，用1M NaOH值调pH节7.3，分装后置于121℃高压锅中灭菌约20min，冷却后于4℃保存备用。
70mm血平板培养基（郑州人福博赛生物技术有限责任公司）
1．1．3 主要试剂 革兰氏染液；细菌微量生化反应管及药敏纸片（杭州天和微生物试剂有限公司）；DL2000 DNA Marker、LA Taq酶、2×GC BufferⅠ、dNTP mixture 均为大连TaKaRa公司产品；琼脂糖（北京鼎国生物技术公司）；溴化乙锭；其余均为国产分析纯试剂。
1．1．4 主要仪器设备 电子天平；蒸汽高压锅；涡旋快速混匀器；LX100手掌型离心机（江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；隔水式恒温培养箱（上海索普仪器有限公司）；恒温培养摇床（太仓华利达实验设备公司）；电热恒温水槽（上海一恒科技有限公司）；无菌操作台（苏净集团安泰公司）；移液器（德国eppendorf公司）；Centrifuge5804R型台式高速冷冻离心机（德国eppendorf公司）；PCR仪（日本TaKaRa公司）；凝胶成像系统（中国Tanon公司）；水平电泳槽（中国Tanon公司）
1．1．5 实验动物 C57/B小鼠（实验室自繁自养）
1．2 方法
1．2．1 细菌的分离培养
1．2．1.1 样品处理 无菌操作下分别称取5g采集的样品，加入100mL带玻璃珠的三角瓶中，加入45mL灭菌生理盐水，在摇床上37℃、200r/min充分匀质30min。然后80℃水浴20min，以杀灭不耐热的细菌。将经过热处理的混悬液移取1mL置9mL LB液体培养基中，混合均匀后置于摇床上37℃、200r/min培养24h。
1．2．1.2 分离培养 取LB液体培养基中的增菌培养物在血平板培养基上划线培养[9]。画线培养时先从增菌培养物中取少量材料涂布于培养基边缘，然后将接种环上多余的材料在火焰中烧毁，待接种环冷却后，再与所涂材料的地方轻轻接触，开始画线。画线时接种环应和平皿内琼脂平行，避免划破培养基。且画线不易过密，以免形成菌苔。接种完毕，做好标记，倒扣平皿37℃培养24h。
1．2．1.3 增菌培养及保存 挑选出血平板培养基上有溶血特征的单菌落，作为疑似有致病能力的受试菌株。挑取受试菌株接种于5mL LB液体培养基，37℃、200r/min恒温摇床培养24h，待培养基变混浊，取部分菌液加30％的甘油于70℃保存备用。
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