奶牛瘤胃高效产氨菌富集分离与鉴定
导致反刍动物的氮利用率低的主要原因之一，是反刍动物瘤胃中高效产氨菌（HAB）产氨速度过快，本试验以安装有瘤胃瘘管的3头奶牛瘤胃内容物为接种材料，采用选择性液体培养基对瘤胃HAB进行富集，其次使用固体培养基对HAB进行分离、纯化，随后采用分子生物学方法对其进行鉴定，最后对分离出的一株HAB生长及产氨特性进行研究。试验结果表明莫能菌素可通过抑制菌群数量进而减少富集培养基中氨的生成；通过富集、分离和纯化，最终获得了3株的纯菌，16S rRNA测序比对结果表明3株纯菌与Enterococcus faecalis OG1RF相似性达99%；菌株HAB1属革兰氏阴性菌，繁殖和产氨速率快，在8h左右即可达到峰值，随后进入平台期。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract. 1
Key words 1
引言 1
1材料与方法 2
1.1试验所需仪器 2
1.2富集培养基 2
1.3继代培养及样品采集和分析 2
1.4高效产氨菌的分离 3
1.5高效产氨菌的纯化 3
1.6分离高效产氨菌的DNA提取及分子鉴定 3
1.7分离高效产氨菌的革兰氏染色及形态观察 3
1.8分离高效产氨菌的生长及产氨特性 4
2 结果与分析 4
2.1不同富集培养条件下吸光度及氨氮浓度变化 4
2.2高效产氨菌的纯化和鉴定 4
2.3分离纯化后的高效产氨菌HAB1拍照鉴定 4
3 讨论 5
4 结论 6
致谢 6
参考文献 6
附录 8 奶牛瘤胃高效产氨菌富集、分离与鉴定
引言
反刍动物的氮的平均的利用效率大约在25%左右[1]，其中导致氮无效利用率较高的最重要的原因便是瘤胃的代谢[2]。有研究表明，微生物可以将瘤胃中大部分的饲料氨基酸氮降解，生成氨[3]，因为氨产生的速度远远大于了微生物的利用速度，导致动物体内吸收了过多的氮，这些氮通过在动物体内转化成尿素，并随着尿液排出体外[4]。氮素的大量流失不单单造成了饲料蛋白质资源浪费，并且增加了对环境的环 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
境污染。在反刍动物体内，主要有两种细菌控制瘤胃内的氨基酸脱氨基作用，一种细菌的脱氨基活性不是很高，不过数目较多；另一种细菌的每种菌中均具有很高的特异性和脱氨基活性，不过数量较少。这两种细菌被人们统称为HAB[5]。虽然后一种的菌数目不超过瘤胃细菌总数的5%, 但是它的产氨速度是第一种细菌的2030倍，大约占瘤胃中总产氨能力的3550%[6]。因此，瘤胃中引起反刍动物低的主要原因就是高效产氨菌速度太快[7]。即使全部已经分离出的高效产氨菌具有一些共有的特点，例如其发育依赖于氨基酸作为氮源，氮源、不可以发酵碳水化合物、对莫能菌素敏感等，但鉴于HAB具有多种代谢类型，并且基因型也有较大差别，大量未纯培养的高效产氨菌大约还未被发现，而它们在瘤胃脱氨基产氨过程中又也许起着十分必要的作用。本研究目的是采用选择性培养基对瘤胃HAB进行富集、分离、纯化及筛选；结合常规生化与现代分子生物学方法对筛选出的HAB进行鉴定研究结果可深化对瘤胃高效产氨菌菌群结构和功能的认识，为反刍动物瘤胃氨的生成与调控提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验所需仪器
载玻片，接种针，烧杯，锥形瓶，玻璃棒，试管，隔水式恒温培养箱，天平，医用净化工作台，蒸汽高压灭菌锅，酒精灯，水浴锅，显微镜等。
1.2富集培养基
试验所需富集培养基原液及培养基配置表见表1和表2。所有溶液配置好后，储存于4℃。维生素溶液使用前需用0.22μm无菌滤膜过滤于灭菌的血清瓶中备用，两周内用完。
表1 富集培养基原液配置表
微量元素溶液：
Na4EDTA:500mg; FeSO4.7H2O:200mg;
MnCl2.4H2O:200mg; ZnSO4.7H2O:10.0g;
H3BO3:30mg; CoCl2.6H2O:20mg;
CuCl2.2H2O:1mg; NiCl2.6H2O:2mg;
FeCl3.6H2O:8.0g;
加蒸馏水至100ml
0.1%（w/v）刃天青溶液：
100mg溶解于100ml蒸馏水
盐溶液 1：
K2 HPO4：1.46g;
加蒸馏水至1000ml
盐溶液2：
KH2PO4：1.46g
Na2SO4：2.4 g
NaCl：2.4g
MgSO4.7H2O：0.5g
CaCl2.2H2O：0.02g
加蒸馏水至1000ml
维生素溶液：
维生素B6:200mg ; 硫辛酸:100mg;
维生素B2:200mg; 对氨基苯甲酸:10mg;
维生素B1:200mg; 叶酸:5mg;
烟酰胺:200mg; 生物素:5mg;
泛酸:200mg; 辅酶B12:5mg;
加蒸馏水至1000ml
表2 富集培养基配置表
原液
体积/重量
原液
体积/重量
盐溶液1
200ml
微量元素溶液
10ml
盐溶液2
200ml
0.1%刃天青溶液
1ml
酪蛋白氨基酸
15g
半胱氨酸盐酸盐
0.6g
NaCO3
4g
维生素溶液
0.1ml/10ml（灭菌后添加)
加蒸馏水至1000ml
1.3继代培养及样品采集和分析
以3头安装有瘤胃瘘管的奶牛瘤胃液为接种材料，瘤胃液经过滤后（四层纱布），接入到预先预热至39℃的两种富集培养基里，每个处理四个重复，间隔24h以10%（v/v）的接种量传代一次，连续传代7次。第17代每次传代后立即采集24h培养物，用于吸光度和氨氮浓度的测定。使用分光光度计测定培养液吸光度，采用比色法方法测定发酵液氨态氮浓度[8]，详细测定步骤如下：
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract. 1
Key words 1
引言 1
1材料与方法 2
1.1试验所需仪器 2
1.2富集培养基 2
1.3继代培养及样品采集和分析 2
1.4高效产氨菌的分离 3
1.5高效产氨菌的纯化 3
1.6分离高效产氨菌的DNA提取及分子鉴定 3
1.7分离高效产氨菌的革兰氏染色及形态观察 3
1.8分离高效产氨菌的生长及产氨特性 4
2 结果与分析 4
2.1不同富集培养条件下吸光度及氨氮浓度变化 4
2.2高效产氨菌的纯化和鉴定 4
2.3分离纯化后的高效产氨菌HAB1拍照鉴定 4
3 讨论 5
4 结论 6
致谢 6
参考文献 6
附录 8 奶牛瘤胃高效产氨菌富集、分离与鉴定
引言
反刍动物的氮的平均的利用效率大约在25%左右[1]，其中导致氮无效利用率较高的最重要的原因便是瘤胃的代谢[2]。有研究表明，微生物可以将瘤胃中大部分的饲料氨基酸氮降解，生成氨[3]，因为氨产生的速度远远大于了微生物的利用速度，导致动物体内吸收了过多的氮，这些氮通过在动物体内转化成尿素，并随着尿液排出体外[4]。氮素的大量流失不单单造成了饲料蛋白质资源浪费，并且增加了对环境的环 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
境污染。在反刍动物体内，主要有两种细菌控制瘤胃内的氨基酸脱氨基作用，一种细菌的脱氨基活性不是很高，不过数目较多；另一种细菌的每种菌中均具有很高的特异性和脱氨基活性，不过数量较少。这两种细菌被人们统称为HAB[5]。虽然后一种的菌数目不超过瘤胃细菌总数的5%, 但是它的产氨速度是第一种细菌的2030倍，大约占瘤胃中总产氨能力的3550%[6]。因此，瘤胃中引起反刍动物低的主要原因就是高效产氨菌速度太快[7]。即使全部已经分离出的高效产氨菌具有一些共有的特点，例如其发育依赖于氨基酸作为氮源，氮源、不可以发酵碳水化合物、对莫能菌素敏感等，但鉴于HAB具有多种代谢类型，并且基因型也有较大差别，大量未纯培养的高效产氨菌大约还未被发现，而它们在瘤胃脱氨基产氨过程中又也许起着十分必要的作用。本研究目的是采用选择性培养基对瘤胃HAB进行富集、分离、纯化及筛选；结合常规生化与现代分子生物学方法对筛选出的HAB进行鉴定研究结果可深化对瘤胃高效产氨菌菌群结构和功能的认识，为反刍动物瘤胃氨的生成与调控提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验所需仪器
载玻片，接种针，烧杯，锥形瓶，玻璃棒，试管，隔水式恒温培养箱，天平，医用净化工作台，蒸汽高压灭菌锅，酒精灯，水浴锅，显微镜等。
1.2富集培养基
试验所需富集培养基原液及培养基配置表见表1和表2。所有溶液配置好后，储存于4℃。维生素溶液使用前需用0.22μm无菌滤膜过滤于灭菌的血清瓶中备用，两周内用完。
表1 富集培养基原液配置表
微量元素溶液：
Na4EDTA:500mg; FeSO4.7H2O:200mg;
MnCl2.4H2O:200mg; ZnSO4.7H2O:10.0g;
H3BO3:30mg; CoCl2.6H2O:20mg;
CuCl2.2H2O:1mg; NiCl2.6H2O:2mg;
FeCl3.6H2O:8.0g;
加蒸馏水至100ml
0.1%（w/v）刃天青溶液：
100mg溶解于100ml蒸馏水
盐溶液 1：
K2 HPO4：1.46g;
加蒸馏水至1000ml
盐溶液2：
KH2PO4：1.46g
Na2SO4：2.4 g
NaCl：2.4g
MgSO4.7H2O：0.5g
CaCl2.2H2O：0.02g
加蒸馏水至1000ml
维生素溶液：
维生素B6:200mg ; 硫辛酸:100mg;
维生素B2:200mg; 对氨基苯甲酸:10mg;
维生素B1:200mg; 叶酸:5mg;
烟酰胺:200mg; 生物素:5mg;
泛酸:200mg; 辅酶B12:5mg;
加蒸馏水至1000ml
表2 富集培养基配置表
原液
体积/重量
原液
体积/重量
盐溶液1
200ml
微量元素溶液
10ml
盐溶液2
200ml
0.1%刃天青溶液
1ml
酪蛋白氨基酸
15g
半胱氨酸盐酸盐
0.6g
NaCO3
4g
维生素溶液
0.1ml/10ml（灭菌后添加)
加蒸馏水至1000ml
1.3继代培养及样品采集和分析
以3头安装有瘤胃瘘管的奶牛瘤胃液为接种材料，瘤胃液经过滤后（四层纱布），接入到预先预热至39℃的两种富集培养基里，每个处理四个重复，间隔24h以10%（v/v）的接种量传代一次，连续传代7次。第17代每次传代后立即采集24h培养物，用于吸光度和氨氮浓度的测定。使用分光光度计测定培养液吸光度，采用比色法方法测定发酵液氨态氮浓度[8]，详细测定步骤如下：
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