马链球菌兽疫亚种荚膜结构功能的研究
马链球菌兽疫亚种荚膜结构功能的研究[20200507184355]
摘要：马链球菌兽疫亚种（SEZ）是引起猪链球菌病的主要病原之一，给我国的养猪业造成严重的经济损失，该菌也可感染人类，引起脑膜炎等疾病。研究表明，猪链球菌2型荚膜缺失株在粘附和侵入细胞、刺激细胞分泌炎性因子等方面与野毒株有显著差异。为研究SEZ荚膜结构的功能，本实验从SEZ荚膜缺失株对细胞的粘附能力及刺激细胞分泌MMP-9的能力与野生株的差异进行研究。实验利用SEZ野生株C55138和荚膜缺失株C55138△HasB，分别与鼠微血管内皮细胞（bEnd.3）、鼠巨噬细胞（Raw264.7）共同孵育后进行免疫荧光染色，检测荚膜结构对SEZ粘附能力的影响，并进行定量ELISA测定细胞因子MMP-9的分泌水平。结果表明，荚膜缺失株对细胞的粘附能力相对野生株有显著提高，但是ELISA结果表明，荚膜缺失株刺激细胞分泌MMP-9的水平与野生株无显著差异。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
关键字:马链球菌兽疫亚种；荚膜缺失株；MMP-9
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1 菌株和细胞2
1.1.2 实验试剂2
1.2 方法 2
1.2.1 C55138和C55138△HasB生长标准曲线的测定2
1.2.2 细胞培养3
1.2.3细胞计数3
1.2.4免疫荧光染色3
1.2.5 ELISA样品准备3
1.2.6金属蛋白酶9分泌的测定4
2 结果与分析5
2.1 C55138和C55138△HasB生长标准曲线的测定5
2.2免疫荧光染色6
2.3金属蛋白酶9分泌的测定8
3 讨论 10
致谢10
参考文献10
图1 C55138 OD600和细菌数线性关系标准曲线5图2 C55138△HasB OD600和细菌数线性关系标准曲线6图3 C55138△HasB和C55138对细胞的粘附7图4 免疫荧光法染色检测C55138△HasB的粘附8图5 免疫荧光法染色检测C55138的粘附8图6 标准品OD600和标准品浓度线性关系标准曲线9图7 C55138和C55138△HasB刺激细胞MMP-9的分泌9
马链球菌兽疫亚种荚膜结构功能的研究
引言
马链球菌兽疫亚种（Streptococcus equi ssp. zooepidemicus，SEZ）属于兰氏分群的C群链球菌，可以导致多种动物疾病，引起败血症、脑膜炎、关节炎、心内膜炎等。SEZ是引起猪链球菌病（S *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
wine streptococcosis）的主要病原之一，在20世纪70~80年代，从我国各地发生猪链球菌病的病猪中分离的链球菌株，多数为本菌[1]。人类食用被该菌污染的猪肉或者接触患病的猪也会被感染[2]，表现为脑膜炎、菌血症、急性肾炎、化脓性关节炎、肺炎等，严重者甚至死亡[3-6]。
细菌跨越血脑屏障进入细胞有3种可能的途径[7]，即跨细胞途径，细胞旁路途径和通过巨噬细胞转移途径。跨细胞途径中，细菌首先粘附于细胞上，进而侵入细胞，通过极性转移，从细胞血液侧转移到脑脊液侧，进而侵入中枢神经系统。细胞旁路途径是细菌通过信号分子、配体受体相互作用或酶的作用，同时使机体分泌细胞因子，作用于血脑屏障基质，使之通透性增加，从而有利于细菌的侵入。通过巨噬细胞转移途径是细菌被组织或血液中的巨噬细胞吞噬，随巨噬细胞穿过血脑屏障的过程中一起进入中枢神经系统。但是到目前为止，马链球菌兽疫亚种通过何种途径穿过血脑屏障进入中枢神经系统尚有待研究。
相关研究表明，猪链球菌荚膜缺失株由于能更充分的暴露细胞壁成分，在细菌粘附、侵入细胞和刺激细胞分泌炎症因子等方面与野毒株有显著差异[8]，因此可能马链球菌兽疫亚种荚膜缺失株也有类似特性，即荚膜缺失株更易粘附、侵入细胞内，如果得到证实，则可更方便地通过荚膜缺失株来研究马链球菌兽疫亚种所致脑膜炎的致病机理，因此对马链球菌兽疫亚种荚膜缺失株C55138△HasB的细胞粘附能力和刺激炎症因子分泌等方面的研究具有重要意义。
本实验使用马链球菌兽疫亚种野生株C55138和荚膜缺失株C55138△HasB，分别与鼠微血管内皮细胞（bEnd.3）和鼠巨噬细胞（Raw264.7）共同孵育，然后进行免疫荧光染色，并用荧光显微镜观察两种菌株对细胞的粘附，从而探究C55138 △HasB对细胞的粘附能力是否比C55138显著增加。并且将C55138和C55138△HasB分别定量侵袭bEnd.3及Raw264.7后检测MMP-9的分泌变化，探究马链球菌兽疫亚种作用下两种细胞MMP-9分泌的不同及细菌荚膜对诱导分泌细胞因子MMP-9的作用。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1 菌株和细胞
马链球菌兽疫亚种野生株C55138和荚膜缺失株C55138△HasB、鼠微血管内皮细胞（bEnd.3）、鼠巨噬细胞（Raw264.7），均由大学动物医学院微生物与免疫学学科组保存。
1.1.2 实验试剂
THB购自美国BD公司，DMEM购自加拿大维森特生物技术有限公司，FBS、胰酶购自美国Gibco公司，牛血清白蛋白BSA、Triton X-100购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，PBS（pH=7.4），4 %甲醛，兔抗ATCC35246全菌多克隆血清、鼠抗ATCC35246全菌多克隆血清由大学动物医学院微生物与免疫学学科组制备，Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG、Alexa Fluor 594标记山羊抗兔IgG、Alexa Fluor 488标记山羊抗小鼠IgG 、DAPI、Actin-Traker Green购自南京碧云天公司，50 %甘油，基质金属蛋白酶-9(总) ELISA 试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
75q2WSv-TPAyTOrNCi6cilS3YJrIE8jfdnDT17g>。
1.2 方法
1.2.1 C55138和C55138△HasB生长标准曲线的测定
将C55138和C55138△HasB分别在THA平板上划线，37 ℃培养12-16个小时。挑单菌落转接到5 ml试管中，置于37 ℃摇床中培养16个小时。准备10个装有 5 ml THB的试管，按1:100的比例将菌液转接到这10个试管中，37 ℃摇床中培养2小时。拿出上述10个试管，取其中1个试管， 其他的放在室温条件下，取出1 ml 菌液，5000 r/min离心5 min，用1 ml DMEM + 2 % FBS重悬，洗两次，然后用1 ml DMEM + 2 % FBS重悬。用DMEM + 2 % FBS调零，对以上菌液测OD600值，其中0.2-0.8为有效值。分别稀释105、106倍，每个稀释度涂3个平板。其他9个试管依次按上述方法操作。37 ℃培养12个小时左右，数菌落数。用OD600值和菌落数做标准曲线。
1.2.2 细胞培养
鼠微血管内皮细胞（bEnd.3）的培养 将铺满bEnd.3的25 cm2细胞瓶中的培养液倒掉，加入4 ml左右的胰酶，摇晃几下后倒掉，加入6-8滴胰酶，放在37 ℃、5 % CO2的温箱中消化3 min，加入4 ml左右的DMEM + 10 % FBS，吹打几十下，使细胞分散，取一半加入新的细胞瓶，然后分别继续加入DMEM + 10 % FBS至10 ml左右，盖好瓶盖，置于温箱中培养。
根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。应记住由于样品稀释了N倍，其实际浓度应该 × N。
2 结果与分析
2.1 C55138和C55138△HasB生长标准曲线的测定
每个稀释度涂的3个平板上菌落数的平均值为细菌数，以OD600值为横坐标，细菌数为纵坐标，单位108，做标准曲线，得到C55138和C55138△HasB的标准曲线。
摘要：马链球菌兽疫亚种（SEZ）是引起猪链球菌病的主要病原之一，给我国的养猪业造成严重的经济损失，该菌也可感染人类，引起脑膜炎等疾病。研究表明，猪链球菌2型荚膜缺失株在粘附和侵入细胞、刺激细胞分泌炎性因子等方面与野毒株有显著差异。为研究SEZ荚膜结构的功能，本实验从SEZ荚膜缺失株对细胞的粘附能力及刺激细胞分泌MMP-9的能力与野生株的差异进行研究。实验利用SEZ野生株C55138和荚膜缺失株C55138△HasB，分别与鼠微血管内皮细胞（bEnd.3）、鼠巨噬细胞（Raw264.7）共同孵育后进行免疫荧光染色，检测荚膜结构对SEZ粘附能力的影响，并进行定量ELISA测定细胞因子MMP-9的分泌水平。结果表明，荚膜缺失株对细胞的粘附能力相对野生株有显著提高，但是ELISA结果表明，荚膜缺失株刺激细胞分泌MMP-9的水平与野生株无显著差异。
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关键字:马链球菌兽疫亚种；荚膜缺失株；MMP-9
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1 菌株和细胞2
1.1.2 实验试剂2
1.2 方法 2
1.2.1 C55138和C55138△HasB生长标准曲线的测定2
1.2.2 细胞培养3
1.2.3细胞计数3
1.2.4免疫荧光染色3
1.2.5 ELISA样品准备3
1.2.6金属蛋白酶9分泌的测定4
2 结果与分析5
2.1 C55138和C55138△HasB生长标准曲线的测定5
2.2免疫荧光染色6
2.3金属蛋白酶9分泌的测定8
3 讨论 10
致谢10
参考文献10
图1 C55138 OD600和细菌数线性关系标准曲线5图2 C55138△HasB OD600和细菌数线性关系标准曲线6图3 C55138△HasB和C55138对细胞的粘附7图4 免疫荧光法染色检测C55138△HasB的粘附8图5 免疫荧光法染色检测C55138的粘附8图6 标准品OD600和标准品浓度线性关系标准曲线9图7 C55138和C55138△HasB刺激细胞MMP-9的分泌9
马链球菌兽疫亚种荚膜结构功能的研究
引言
马链球菌兽疫亚种（Streptococcus equi ssp. zooepidemicus，SEZ）属于兰氏分群的C群链球菌，可以导致多种动物疾病，引起败血症、脑膜炎、关节炎、心内膜炎等。SEZ是引起猪链球菌病（S *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
wine streptococcosis）的主要病原之一，在20世纪70~80年代，从我国各地发生猪链球菌病的病猪中分离的链球菌株，多数为本菌[1]。人类食用被该菌污染的猪肉或者接触患病的猪也会被感染[2]，表现为脑膜炎、菌血症、急性肾炎、化脓性关节炎、肺炎等，严重者甚至死亡[3-6]。
细菌跨越血脑屏障进入细胞有3种可能的途径[7]，即跨细胞途径，细胞旁路途径和通过巨噬细胞转移途径。跨细胞途径中，细菌首先粘附于细胞上，进而侵入细胞，通过极性转移，从细胞血液侧转移到脑脊液侧，进而侵入中枢神经系统。细胞旁路途径是细菌通过信号分子、配体受体相互作用或酶的作用，同时使机体分泌细胞因子，作用于血脑屏障基质，使之通透性增加，从而有利于细菌的侵入。通过巨噬细胞转移途径是细菌被组织或血液中的巨噬细胞吞噬，随巨噬细胞穿过血脑屏障的过程中一起进入中枢神经系统。但是到目前为止，马链球菌兽疫亚种通过何种途径穿过血脑屏障进入中枢神经系统尚有待研究。
相关研究表明，猪链球菌荚膜缺失株由于能更充分的暴露细胞壁成分，在细菌粘附、侵入细胞和刺激细胞分泌炎症因子等方面与野毒株有显著差异[8]，因此可能马链球菌兽疫亚种荚膜缺失株也有类似特性，即荚膜缺失株更易粘附、侵入细胞内，如果得到证实，则可更方便地通过荚膜缺失株来研究马链球菌兽疫亚种所致脑膜炎的致病机理，因此对马链球菌兽疫亚种荚膜缺失株C55138△HasB的细胞粘附能力和刺激炎症因子分泌等方面的研究具有重要意义。
本实验使用马链球菌兽疫亚种野生株C55138和荚膜缺失株C55138△HasB，分别与鼠微血管内皮细胞（bEnd.3）和鼠巨噬细胞（Raw264.7）共同孵育，然后进行免疫荧光染色，并用荧光显微镜观察两种菌株对细胞的粘附，从而探究C55138 △HasB对细胞的粘附能力是否比C55138显著增加。并且将C55138和C55138△HasB分别定量侵袭bEnd.3及Raw264.7后检测MMP-9的分泌变化，探究马链球菌兽疫亚种作用下两种细胞MMP-9分泌的不同及细菌荚膜对诱导分泌细胞因子MMP-9的作用。
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1 菌株和细胞
马链球菌兽疫亚种野生株C55138和荚膜缺失株C55138△HasB、鼠微血管内皮细胞（bEnd.3）、鼠巨噬细胞（Raw264.7），均由大学动物医学院微生物与免疫学学科组保存。
1.1.2 实验试剂
THB购自美国BD公司，DMEM购自加拿大维森特生物技术有限公司，FBS、胰酶购自美国Gibco公司，牛血清白蛋白BSA、Triton X-100购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，PBS（pH=7.4），4 %甲醛，兔抗ATCC35246全菌多克隆血清、鼠抗ATCC35246全菌多克隆血清由大学动物医学院微生物与免疫学学科组制备，Alexa Fluor 488标记山羊抗兔IgG、Alexa Fluor 594标记山羊抗兔IgG、Alexa Fluor 488标记山羊抗小鼠IgG 、DAPI、Actin-Traker Green购自南京碧云天公司，50 %甘油，基质金属蛋白酶-9(总) ELISA 试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司
75q2WSv-TPAyTOrNCi6cilS3YJrIE8jfdnDT17g>。
1.2 方法
1.2.1 C55138和C55138△HasB生长标准曲线的测定
将C55138和C55138△HasB分别在THA平板上划线，37 ℃培养12-16个小时。挑单菌落转接到5 ml试管中，置于37 ℃摇床中培养16个小时。准备10个装有 5 ml THB的试管，按1:100的比例将菌液转接到这10个试管中，37 ℃摇床中培养2小时。拿出上述10个试管，取其中1个试管， 其他的放在室温条件下，取出1 ml 菌液，5000 r/min离心5 min，用1 ml DMEM + 2 % FBS重悬，洗两次，然后用1 ml DMEM + 2 % FBS重悬。用DMEM + 2 % FBS调零，对以上菌液测OD600值，其中0.2-0.8为有效值。分别稀释105、106倍，每个稀释度涂3个平板。其他9个试管依次按上述方法操作。37 ℃培养12个小时左右，数菌落数。用OD600值和菌落数做标准曲线。
1.2.2 细胞培养
鼠微血管内皮细胞（bEnd.3）的培养 将铺满bEnd.3的25 cm2细胞瓶中的培养液倒掉，加入4 ml左右的胰酶，摇晃几下后倒掉，加入6-8滴胰酶，放在37 ℃、5 % CO2的温箱中消化3 min，加入4 ml左右的DMEM + 10 % FBS，吹打几十下，使细胞分散，取一半加入新的细胞瓶，然后分别继续加入DMEM + 10 % FBS至10 ml左右，盖好瓶盖，置于温箱中培养。
根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。应记住由于样品稀释了N倍，其实际浓度应该 × N。
2 结果与分析
2.1 C55138和C55138△HasB生长标准曲线的测定
每个稀释度涂的3个平板上菌落数的平均值为细菌数，以OD600值为横坐标，细菌数为纵坐标，单位108，做标准曲线，得到C55138和C55138△HasB的标准曲线。
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