云南玉溪地区流浪犬巴贝斯虫感染调查
云南玉溪地区流浪犬巴贝斯虫感染调查[20200507191313]
摘要：犬巴贝斯虫病是一类发热性、蜱传性血液原虫病，目前在临床上的危害性仅次于病毒性传染病。为了调查云南玉溪地区流浪犬巴贝斯虫感染情况，本实验用血样采集卡采集了云南玉溪地区2013年10-12月27份流浪犬血液样品，采用PCR及PCR产物测序等方法对血液样品中犬巴贝斯虫进行检测，实验结果表明，该地区流浪犬中未发现犬巴贝斯虫感染。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
关键字:犬巴贝斯虫病；血样采集卡；PCR；测序；
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
引言 3
1 材料与方法 3
1.1 主要试剂 3
1.2 主要仪器设备 4
1.3 血液样品采集 4
1.4 犬血液基因组DNA提取 4
1.5 PCR扩增 4
1.6 PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定 5
1.7 PCR产物测序 5
2 结果与分析 5
2.1 B.com339-F/R 引物扩增结果 5
2.2 B.com1700-F/r 引物扩增结果 5
2.3 PCR产物测序结果 6
3 讨论 6
3．1 犬巴贝斯虫病的传播和流行特点 6
3．2 诊断方法 6
3.3 预防措施 9
3.3.1 限制或禁止犬到有蜱地区活动,切断中间传播环节 9
3.3.2 非疫区用药 9
3.3.3 做好防蜱和灭蜱工作 9
3.3.4 对病犬做到早发现、早诊断、早隔离、早治疗 9
3.4 公共卫生和人畜共患病 9
3.5 云南玉溪地区流浪去巴贝斯虫感染情况 9
3.6 为什么B.com1700 F/R 有扩增 9
致谢 9
参考文献： 9
云南玉溪地区流浪犬巴贝斯虫感染调查
引言
引言：犬巴贝斯虫病是由梨形虫目（Piroplasmida）巴贝斯科（Babesiidae）、巴贝斯属（Babesia）的虫体寄生于犬的红细胞内引发的一类发热性血液原虫疾病。临床上犬通过 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
感染有巴贝斯虫的蜱叮咬吸血而发生。患病犬常表现贫血、发热、黄疸、血红蛋白尿、可视粘膜苍白等症状，有些甚至因溶血性贫血、缺氧性损伤等而致衰竭死亡。目前该病对犬的危害性仅次于病毒性传染病[1]。
该病在世界广泛分布，在热带、亚热带和温带地区特别严重。据病原的抗原性质分类，引起该病的病原主要有3种[2]：犬巴贝斯虫（B.canis），主要分布于欧洲，、美洲和印度；韦氏巴贝斯虫（B.vogeli）主要分布于南美洲；吉氏巴贝斯虫（B.gibsoni）主要分布为亚洲。目前在中国已有报道的为吉氏巴贝斯虫和韦氏巴贝斯虫[3]。
在我国江苏、河南的部分地区也呈地方性流行。巴贝斯虫对良种犬,尤其是军、警犬和猎犬危害严重。据报道,1998年南京某犬场巴贝斯虫感染率达26%[4]。目前，随着经济发展和人们生活水平的提高,伴侣动物饲养量越来越大,尤其是宠物犬越来越多,本病的发病率也逐年上升,危害十分严重。但是目前为止，并没有犬巴贝斯虫病在云南地区的流行情况的相关文献，为了了解犬巴贝斯虫病在该地区的感染情况和流行规律，我们设计了如下实验。
本实验通过收集云南玉溪地区10月的流浪犬血样，通过实验室PCR，测序方法，调查云南玉溪地区犬巴贝斯虫的流行情况来判断该病的流行状况。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
细胞裂解缓冲液：10 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)，0.1 mol/L EDTA (pH8.0)，0.5%(m/v) SDS，20μg/mg无DNase的胰RNase。
Tris酚-氯仿抽提缓冲液： Tris平衡酚与氯仿按体积1:1混匀。
2×Taq PCR Mix，蛋白酶K，普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒等购自天根生化科技（北京）有限公司。
PMD 18-T载体等购自宝生物工程（大连）有限公司。
血样采集卡购自天津诺维莱博科技有限公司。
1.2 主要仪器设备
Allegla 64R低温冷冻离心机 美国BECKMANCOULTER；Veriti? 96 PCR仪 美国 Applied Biosystems；凝胶成像系统 美国 Bio-Rad。
1.3 血液样品采集
共收集了血液样品27份，全部都是来自云南玉溪地区的流浪犬。采血前，将流浪犬的信息记录好。采血时注意消毒，一犬一针，以防感染。同时，采血时要戴一次性手套，不得用手直接接触滤纸区，以防污染。采用犬外侧隐静脉采血的方法，EDTA抗凝，4℃保存，将血液滴加于血样采集卡。然后装入相应血样袋中。一犬一卡一袋，不得混装。装入血卡后，撕去袋口双面胶纸层，将口封严，按规定保存，运输回南京。
阳性对照血液样品采集大学动物医院，通过血常规检查，血涂片镜检确诊为犬巴贝斯虫感染的病犬，采用血液采集卡保存血液样品。
1.4 犬血液基因组DNA提取
首先用打孔器从血样采集卡上剪下直径为5 mm的小血片置于1.5 mL离心管中。然后加入细胞裂解缓冲液450 mL，再加入10 μL蛋白酶K，56 ℃水浴1 h；之后加入Tris酚-氯仿抽提缓冲液500 mL，上下颠倒混匀；15 ℃，12000 r/min离心5 min，再取上清液放置于新的离心管中；之 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
后再加入40 mL 10 mol/L的醋酸钠，1 mL无水乙醇，上下颠倒混匀，15 ℃，12000 r/min离心5 min，弃去上清液；再加入1 mL 70%乙醇，混匀，15 ℃，12000 r/min离心5 min。把乙醇完全倒干净，离心管可以放在桌上导致自然风干，加入100 mLddH2O溶解DNA，-20 ℃保存备用。
1.5 PCR扩增
根据Birkenheuer报道[5]的犬巴贝斯虫18S rRNA基因设计引物，共设计了两套引物，该引物为犬巴贝斯虫通用引物。第一套上游引物B.com339-F 5-GTCTTGTAATTGGAATGATGGTG AC-3 ，下游引物B.com339-R 5-ATGCCCCCAACCGTTCCTATTA-3，扩增目的片段长度为339bp。第二套上游引物为B.com 1700-F: 5′- AACCTGGTTG ATCCTGCCAGTAGTCAT-3′ ,下游引物为B.com 1700-F 5′- GAATGATCCTTCCGCA GGTTCACCTAC-3′ [6]，扩增犬巴贝斯虫18S rRNA基因全长，目的片段约1700 bp。引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。
第一套引物PCR反应体系如下：
上游引物 B.com339-F（10 mM） 0.5 mL
下游引物 B.com339-R（10 mM） 0.5 mL
模板DNA 8 mL
2×Taq PCR Mix 12.5 mL
感谢大动物医院的医生们和护士们，实习期间给予我的关怀与帮助。
参考文献：
[1] GREENE C. E. Infectious Diseases of the Dog and Cat [M]. 3rd ed. Philadelphia：W.B.Saunders，2006,722-736.
摘要：犬巴贝斯虫病是一类发热性、蜱传性血液原虫病，目前在临床上的危害性仅次于病毒性传染病。为了调查云南玉溪地区流浪犬巴贝斯虫感染情况，本实验用血样采集卡采集了云南玉溪地区2013年10-12月27份流浪犬血液样品，采用PCR及PCR产物测序等方法对血液样品中犬巴贝斯虫进行检测，实验结果表明，该地区流浪犬中未发现犬巴贝斯虫感染。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
关键字:犬巴贝斯虫病；血样采集卡；PCR；测序；
目录
摘要 3
关键词 3
Abstract 3
Key words 3
引言 3
1 材料与方法 3
1.1 主要试剂 3
1.2 主要仪器设备 4
1.3 血液样品采集 4
1.4 犬血液基因组DNA提取 4
1.5 PCR扩增 4
1.6 PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定 5
1.7 PCR产物测序 5
2 结果与分析 5
2.1 B.com339-F/R 引物扩增结果 5
2.2 B.com1700-F/r 引物扩增结果 5
2.3 PCR产物测序结果 6
3 讨论 6
3．1 犬巴贝斯虫病的传播和流行特点 6
3．2 诊断方法 6
3.3 预防措施 9
3.3.1 限制或禁止犬到有蜱地区活动,切断中间传播环节 9
3.3.2 非疫区用药 9
3.3.3 做好防蜱和灭蜱工作 9
3.3.4 对病犬做到早发现、早诊断、早隔离、早治疗 9
3.4 公共卫生和人畜共患病 9
3.5 云南玉溪地区流浪去巴贝斯虫感染情况 9
3.6 为什么B.com1700 F/R 有扩增 9
致谢 9
参考文献： 9
云南玉溪地区流浪犬巴贝斯虫感染调查
引言
引言：犬巴贝斯虫病是由梨形虫目（Piroplasmida）巴贝斯科（Babesiidae）、巴贝斯属（Babesia）的虫体寄生于犬的红细胞内引发的一类发热性血液原虫疾病。临床上犬通过 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
感染有巴贝斯虫的蜱叮咬吸血而发生。患病犬常表现贫血、发热、黄疸、血红蛋白尿、可视粘膜苍白等症状，有些甚至因溶血性贫血、缺氧性损伤等而致衰竭死亡。目前该病对犬的危害性仅次于病毒性传染病[1]。
该病在世界广泛分布，在热带、亚热带和温带地区特别严重。据病原的抗原性质分类，引起该病的病原主要有3种[2]：犬巴贝斯虫（B.canis），主要分布于欧洲，、美洲和印度；韦氏巴贝斯虫（B.vogeli）主要分布于南美洲；吉氏巴贝斯虫（B.gibsoni）主要分布为亚洲。目前在中国已有报道的为吉氏巴贝斯虫和韦氏巴贝斯虫[3]。
在我国江苏、河南的部分地区也呈地方性流行。巴贝斯虫对良种犬,尤其是军、警犬和猎犬危害严重。据报道,1998年南京某犬场巴贝斯虫感染率达26%[4]。目前，随着经济发展和人们生活水平的提高,伴侣动物饲养量越来越大,尤其是宠物犬越来越多,本病的发病率也逐年上升,危害十分严重。但是目前为止，并没有犬巴贝斯虫病在云南地区的流行情况的相关文献，为了了解犬巴贝斯虫病在该地区的感染情况和流行规律，我们设计了如下实验。
本实验通过收集云南玉溪地区10月的流浪犬血样，通过实验室PCR，测序方法，调查云南玉溪地区犬巴贝斯虫的流行情况来判断该病的流行状况。
1 材料与方法
1.1 主要试剂
细胞裂解缓冲液：10 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)，0.1 mol/L EDTA (pH8.0)，0.5%(m/v) SDS，20μg/mg无DNase的胰RNase。
Tris酚-氯仿抽提缓冲液： Tris平衡酚与氯仿按体积1:1混匀。
2×Taq PCR Mix，蛋白酶K，普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒等购自天根生化科技（北京）有限公司。
PMD 18-T载体等购自宝生物工程（大连）有限公司。
血样采集卡购自天津诺维莱博科技有限公司。
1.2 主要仪器设备
Allegla 64R低温冷冻离心机 美国BECKMANCOULTER；Veriti? 96 PCR仪 美国 Applied Biosystems；凝胶成像系统 美国 Bio-Rad。
1.3 血液样品采集
共收集了血液样品27份，全部都是来自云南玉溪地区的流浪犬。采血前，将流浪犬的信息记录好。采血时注意消毒，一犬一针，以防感染。同时，采血时要戴一次性手套，不得用手直接接触滤纸区，以防污染。采用犬外侧隐静脉采血的方法，EDTA抗凝，4℃保存，将血液滴加于血样采集卡。然后装入相应血样袋中。一犬一卡一袋，不得混装。装入血卡后，撕去袋口双面胶纸层，将口封严，按规定保存，运输回南京。
阳性对照血液样品采集大学动物医院，通过血常规检查，血涂片镜检确诊为犬巴贝斯虫感染的病犬，采用血液采集卡保存血液样品。
1.4 犬血液基因组DNA提取
首先用打孔器从血样采集卡上剪下直径为5 mm的小血片置于1.5 mL离心管中。然后加入细胞裂解缓冲液450 mL，再加入10 μL蛋白酶K，56 ℃水浴1 h；之后加入Tris酚-氯仿抽提缓冲液500 mL，上下颠倒混匀；15 ℃，12000 r/min离心5 min，再取上清液放置于新的离心管中；之 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
后再加入40 mL 10 mol/L的醋酸钠，1 mL无水乙醇，上下颠倒混匀，15 ℃，12000 r/min离心5 min，弃去上清液；再加入1 mL 70%乙醇，混匀，15 ℃，12000 r/min离心5 min。把乙醇完全倒干净，离心管可以放在桌上导致自然风干，加入100 mLddH2O溶解DNA，-20 ℃保存备用。
1.5 PCR扩增
根据Birkenheuer报道[5]的犬巴贝斯虫18S rRNA基因设计引物，共设计了两套引物，该引物为犬巴贝斯虫通用引物。第一套上游引物B.com339-F 5-GTCTTGTAATTGGAATGATGGTG AC-3 ，下游引物B.com339-R 5-ATGCCCCCAACCGTTCCTATTA-3，扩增目的片段长度为339bp。第二套上游引物为B.com 1700-F: 5′- AACCTGGTTG ATCCTGCCAGTAGTCAT-3′ ,下游引物为B.com 1700-F 5′- GAATGATCCTTCCGCA GGTTCACCTAC-3′ [6]，扩增犬巴贝斯虫18S rRNA基因全长，目的片段约1700 bp。引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。
第一套引物PCR反应体系如下：
上游引物 B.com339-F（10 mM） 0.5 mL
下游引物 B.com339-R（10 mM） 0.5 mL
模板DNA 8 mL
2×Taq PCR Mix 12.5 mL
感谢大动物医院的医生们和护士们，实习期间给予我的关怀与帮助。
参考文献：
[1] GREENE C. E. Infectious Diseases of the Dog and Cat [M]. 3rd ed. Philadelphia：W.B.Saunders，2006,722-736.
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