攀枝花市猪肉氯霉素残留检测与市场调查
攀枝花市猪肉氯霉素残留检测与市场调查[20200507191229]
摘要：为了解猪肉氯霉素残留检测试验常用方法的优缺点和攀枝花市区市场销售猪肉的氯霉素残留情况，从攀枝花市市区中选取了具有代表性的4个大型市场及2个大型超市进行采样，在3月24日至5月4日共6周时间内，每周采样1次，均采用ELISA法对样品进行氯霉素残留检测试验，从而形成一个短期内的对这6家市场的监控，通过对数据的采集整理与分析，均未发现猪肉氯霉素残留现象。在猪肉氯霉素残留检测试验过程中，查阅并总结了实际操作的酶联免疫法和高效液相色谱法，其中酶联免疫法有着试样预处理迅捷、所需仪器简单、特异性强、灵敏度高等优点，在基层的实际检测中应用广泛，前景广阔。
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关键字:氯霉素；试剂盒；残留；攀枝花
目录
摘要 3
Abstract 3
引言 3
1 材料与方法 4
1.1 检测方法 4
1.1.1 酶联免疫法（试剂盒） 4
1.1.2 酶联免疫法（试剂盒）检测步骤 4
1.1.3 酶联免疫法（试剂盒）结果判定 5
1.1.4 高效液相色谱法 5
1.1.5 高效液相色谱法测定步骤 5
1.1.6 高效液相色谱法结果计算 5
1.2 调查方法 6
1.2.1 抽样方法 6
1.2.2 试验安排 6
2 结果 6
2.1 标准曲线的绘制 6
2.2 各采集地试验结果 7
3 讨论 8
3.1 试验方法比较 8
3.2 调查结果分析 8
致谢 9
参考文献 9
攀枝花市猪肉氯霉素残留检测与市场调查
引言
之一随着生活水平的提高，人们对食品安全的关注也不断加深，尤其是与生活息息相关、密不可分的猪肉的质量安全。所以猪肉的兽药残留检测问题也走进了人们的视线。氯霉素(Chloroamphenicol, CAP)作为影响人类健康之一的抗生素类残留，是残留检测的重点之一。氯霉素类抗生素可通过脂溶性弥散进入细菌细胞内，主要作用于细菌70s核糖体的50s亚基[1]，抑制转肽酶，使肽链的增长受阻，抑制了肽链的形成，从而阻止蛋白质的合成。高浓度时或对其高度敏感的细菌也呈杀菌作用，属抑菌性广谱抗生素[2]。氯霉素对骨髓贩造血机能有抑制作用，可引起血小板减少性紫殿 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
、粒细胞缺乏症、再生障碍性贫血、溶血性[3]等，对早产儿和新生儿能招致药物蓄积中毒[4]，妊娠末期和临产的24小时内孕母使用氯霉素，会引起“灰婴综合症”。氯霉素对我国出口贸易造成了极大影响影响2005年我国向欧盟出口的水产龙头企业总数为95家，每个企业因欧盟禁令遭受的损失平均在300万美元至500万美元之间[5]。
1 材料与方法
1.1 检测方法
氯霉素残留检测方法的建立始于20世纪70年代，到目前为止，主要有微生物法、免疫分析法、色谱分析法、电化学方法及生物芯片[6]等。本文主要介绍在四川省攀西无公害农产品监测中心实习中试验室拥有足够条件、可以实际操作的两种方法，即免疫分析法中的酶联免疫法（试剂盒）及色谱分析法中的高效液相色谱法。
1.1.1 酶联免疫法（试剂盒）
（1）试验原理 采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的氯霉素和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗氯霉素抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与其残留物氯霉素的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中氯霉素的含量。
（2）所需的设备和试剂 主要设备为微孔板酶标仪450/630nm；旋转蒸发仪/氮气吹干装置；均质器；振荡器；涡旋仪；离心机；天平：感量0.01g；刻度移液管；洗耳球；容量瓶；玻璃试管；聚苯乙烯离心管；微量移液器。主要试剂为乙酸乙酯（分析纯）；正己烷（分析纯）；去离子水。
（3）提供的材料和试剂 96孔酶标板（包被有偶联抗原）；标准液；高浓度标准品；酶结合物浓缩液；酶结合物稀释液；底物A、B液；终止液；20×浓缩洗涤液；2×浓缩复溶液。
（4）样本前处理 用均质器均质组织样本；称取3.0（误差0.05g）均质物至50mL聚苯乙烯离心管中，加入6mL乙酸乙酯，用振荡器振荡5min，3000g以上，室温离心5min；移取4mL上层有机相至10mL洁净干燥玻璃试管中，于50-60℃水溶氮气流下吹干；加入1mL正己烷，用涡旋仪涡动1min，再加1mL复溶工作液（去离子水与2×浓缩复溶液1:1），用涡旋仪涡动15s，3000g以上，室温离心5min；除去上层有机相，去下层50mL用于分析。
1.1.2 酶联免疫法（试剂盒）检测步骤
将所需试剂从冷藏环境中取出，将模具内所有试剂和酶标板放试验桌回温至室温，每种液体试剂使用前据需摇匀；取出需要数量的微孔板；将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品做两孔平行，并记录样本孔和标准孔所在的位置；加标准品及样本50mL到对应的微孔中；根据需要量将酶结合物浓缩液用酶结合物稀释液按照1:10的比例进行稀释；每孔加入酶结合物工作液50mL，轻轻震荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min；小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，每孔加入洗涤工作液（去离子水与20×浓缩洗涤液1:19）250mL，充分洗涤5-6次，每次间隔20s，泼掉板孔内洗涤液，用吸水纸拍干；每孔加入底物液A液50mL，再加入底物液B液50mL，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境反应20min；每孔加入终止液50mL，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450mm处，测定每孔OD值。
1.1.3 酶联免疫 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
法（试剂盒）结果判定
百分吸光率的计算：标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的平均吸光度值（双孔）除以第一个标准（0标准）的平均吸光度值，再乘以100%。标准曲线的绘制与计算：以标准品百分吸光率为纵坐标，以氯霉素标准品浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中氯霉素实际浓度。
1.1.4 高效液相色谱法
（1） 试验原理 试样中残留的氯霉素经乙酸乙酯提取后，经减压浓缩，用0.5 mol/L高氯酸溶解残渣，用正己烷去除脂肪，经微孔滤膜过滤后，滤液供高效液相色谱分析。
（2）试剂和材料 甲醇：色谱纯；正己烷；氯霉素每毫克相当994单位，含量大于等于99%；乙酸乙酯；高氯酸；氯霉素标准储备液：精确称取 0. 010 g霉素标准品，置于100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。此溶液浓度为 0. 10 mg/mL，置于冰箱中保存，有效期3个月；氯霉素标准工作液：精确吸取5. 0 mL储备液50 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，此溶液浓度 10 毫克/mL，置于冰箱保存，有效期半个月，临用前取此液用0. 5 mol/L高氯酸稀释成适当浓度的标准工作液。
（3）仪器和设备 高效液相色谱仪(配紫外检测器)；旋转蒸发仪；涡流混匀器；超声波发生器；旋转蒸发仪；微孔滤膜过滤。
1.1.5 高效液相色谱法测定步骤
（1） 提取 取200 g试样绞碎，称取20 g(精确至 0.01 g)绞碎后的试样，置于100 mL具塞三角瓶中，加人40 mL乙酸乙酯，振摇，超声提取 30 min，过滤，滤液放于另一三角瓶中。再加人 20 mL乙酸乙酯于试样中，超声提取15 min，过滤，滤液合并，滤渣再加 20 mL乙酸乙酯超声提取 15 min，过滤，滤液合并，全部滤液合并转人浓缩瓶中。
3.2 调查结果分析
根据表3-表8的结果显示，未见采集地猪肉样品氯霉素残留。
摘要：为了解猪肉氯霉素残留检测试验常用方法的优缺点和攀枝花市区市场销售猪肉的氯霉素残留情况，从攀枝花市市区中选取了具有代表性的4个大型市场及2个大型超市进行采样，在3月24日至5月4日共6周时间内，每周采样1次，均采用ELISA法对样品进行氯霉素残留检测试验，从而形成一个短期内的对这6家市场的监控，通过对数据的采集整理与分析，均未发现猪肉氯霉素残留现象。在猪肉氯霉素残留检测试验过程中，查阅并总结了实际操作的酶联免疫法和高效液相色谱法，其中酶联免疫法有着试样预处理迅捷、所需仪器简单、特异性强、灵敏度高等优点，在基层的实际检测中应用广泛，前景广阔。
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关键字:氯霉素；试剂盒；残留；攀枝花
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摘要 3
Abstract 3
引言 3
1 材料与方法 4
1.1 检测方法 4
1.1.1 酶联免疫法（试剂盒） 4
1.1.2 酶联免疫法（试剂盒）检测步骤 4
1.1.3 酶联免疫法（试剂盒）结果判定 5
1.1.4 高效液相色谱法 5
1.1.5 高效液相色谱法测定步骤 5
1.1.6 高效液相色谱法结果计算 5
1.2 调查方法 6
1.2.1 抽样方法 6
1.2.2 试验安排 6
2 结果 6
2.1 标准曲线的绘制 6
2.2 各采集地试验结果 7
3 讨论 8
3.1 试验方法比较 8
3.2 调查结果分析 8
致谢 9
参考文献 9
攀枝花市猪肉氯霉素残留检测与市场调查
引言
之一随着生活水平的提高，人们对食品安全的关注也不断加深，尤其是与生活息息相关、密不可分的猪肉的质量安全。所以猪肉的兽药残留检测问题也走进了人们的视线。氯霉素(Chloroamphenicol, CAP)作为影响人类健康之一的抗生素类残留，是残留检测的重点之一。氯霉素类抗生素可通过脂溶性弥散进入细菌细胞内，主要作用于细菌70s核糖体的50s亚基[1]，抑制转肽酶，使肽链的增长受阻，抑制了肽链的形成，从而阻止蛋白质
、粒细胞缺乏症、再生障碍性贫血、溶血性[3]等，对早产儿和新生儿能招致药物蓄积中毒[4]，妊娠末期和临产的24小时内孕母使用氯霉素，会引起“灰婴综合症”。氯霉素对我国出口贸易造成了极大影响影响2005年我国向欧盟出口的水产龙头企业总数为95家，每个企业因欧盟禁令遭受的损失平均在300万美元至500万美元之间[5]。
1 材料与方法
1.1 检测方法
氯霉素残留检测方法的建立始于20世纪70年代，到目前为止，主要有微生物法、免疫分析法、色谱分析法、电化学方法及生物芯片[6]等。本文主要介绍在四川省攀西无公害农产品监测中心实习中试验室拥有足够条件、可以实际操作的两种方法，即免疫分析法中的酶联免疫法（试剂盒）及色谱分析法中的高效液相色谱法。
1.1.1 酶联免疫法（试剂盒）
（1）试验原理 采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的氯霉素和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗氯霉素抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与其残留物氯霉素的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中氯霉素的含量。
（2）所需的设备和试剂 主要设备为微孔板酶标仪450/630nm；旋转蒸发仪/氮气吹干装置；均质器；振荡器；涡旋仪；离心机；天平：感量0.01g；刻度移液管；洗耳球；容量瓶；玻璃试管；聚苯乙烯离心管；微量移液器。主要试剂为乙酸乙酯（分析纯）；正己烷（分析纯）；去离子水。
（3）提供的材料和试剂 96孔酶标板（包被有偶联抗原）；标准液；高浓度标准品；酶结合物浓缩液；酶结合物稀释液；底物A、B液；终止液；20×浓缩洗涤液；2×浓缩复溶液。
（4）样本前处理 用均质器均质组织样本；称取3.0（误差0.05g）均质物至50mL聚苯乙烯离心管中，加入6mL乙酸乙酯，用振荡器振荡5min，3000g以上，室温离心5min；移取4mL上层有机相至10mL洁净干燥玻璃试管中，于50-60℃水溶氮气流下吹干；加入1mL正己烷，用涡旋仪涡动1min，再加1mL复溶工作液（去离子水与2×浓缩复溶液1:1），用涡旋仪涡动15s，3000g以上，室温离心5min；除去上层有机相，去下层50mL用于分析。
1.1.2 酶联免疫法（试剂盒）检测步骤
将所需试剂从冷藏环境中取出，将模具内所有试剂和酶标板放试验桌回温至室温，每种液体试剂使用前据需摇匀；取出需要数量的微孔板；将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品做两孔平行，并记录样本孔和标准孔所在的位置；加标准品及样本50mL到对应的微孔中；根据需要量将酶结合物浓缩液用酶结合物稀释液按照1:10的比例进行稀释；每孔加入酶结合物工作液50mL，轻轻震荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min；小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，每孔加入洗涤工作液（去离子水与20×浓缩洗涤液1:19）250mL，充分洗涤5-6次，每次间隔20s，泼掉板孔内洗涤液，用吸水纸拍干；每孔加入底物液A液50mL，再加入底物液B液50mL，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境反应20min；每孔加入终止液50mL，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450mm处，测定每孔OD值。
1.1.3 酶联免疫 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
法（试剂盒）结果判定
百分吸光率的计算：标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的平均吸光度值（双孔）除以第一个标准（0标准）的平均吸光度值，再乘以100%。标准曲线的绘制与计算：以标准品百分吸光率为纵坐标，以氯霉素标准品浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中氯霉素实际浓度。
1.1.4 高效液相色谱法
（1） 试验原理 试样中残留的氯霉素经乙酸乙酯提取后，经减压浓缩，用0.5 mol/L高氯酸溶解残渣，用正己烷去除脂肪，经微孔滤膜过滤后，滤液供高效液相色谱分析。
（2）试剂和材料 甲醇：色谱纯；正己烷；氯霉素每毫克相当994单位，含量大于等于99%；乙酸乙酯；高氯酸；氯霉素标准储备液：精确称取 0. 010 g霉素标准品，置于100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。此溶液浓度为 0. 10 mg/mL，置于冰箱中保存，有效期3个月；氯霉素标准工作液：精确吸取5. 0 mL储备液50 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，此溶液浓度 10 毫克/mL，置于冰箱保存，有效期半个月，临用前取此液用0. 5 mol/L高氯酸稀释成适当浓度的标准工作液。
（3）仪器和设备 高效液相色谱仪(配紫外检测器)；旋转蒸发仪；涡流混匀器；超声波发生器；旋转蒸发仪；微孔滤膜过滤。
1.1.5 高效液相色谱法测定步骤
（1） 提取 取200 g试样绞碎，称取20 g(精确至 0.01 g)绞碎后的试样，置于100 mL具塞三角瓶中，加人40 mL乙酸乙酯，振摇，超声提取 30 min，过滤，滤液放于另一三角瓶中。再加人 20 mL乙酸乙酯于试样中，超声提取15 min，过滤，滤液合并，滤渣再加 20 mL乙酸乙酯超声提取 15 min，过滤，滤液合并，全部滤液合并转人浓缩瓶中。
3.2 调查结果分析
根据表3-表8的结果显示，未见采集地猪肉样品氯霉素残留。
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