法氏囊活性肽对不同细胞活力的调节作用研究
法氏囊是目前世界上公认的体液免疫中枢免疫器官，其中含有许多生物活性物质。但至今法氏囊活性肽及其机理的研究尚为偏少。鉴于其所具有的重要免疫调节活性以及广泛的生物学活性，本实验以BP7、BP9、BPP-Ⅴ、BHP以及BSP-Ⅱ等五种法氏囊活性肽为研究材料，采用MTT实验分别检测其对BHK-21、PK-15、Vero以及SP2/0四种细胞活性的调节作用。结果显示，多肽对不同细胞活性的调节作用是不同的，不同的多肽对同一种细胞活性的调节作用也是不同的。该研究结果为探究中枢体液免疫器官来源的活性分子调节细胞活性提供了实验参考依据。鉴于本研究中肿瘤细胞种类过少，法氏囊活性肽对肿瘤细胞活性的调节作用还有待于进一步研究。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 2
1 材料与方法 2
1．1 主要材料与试剂 2
1.1.1 法氏囊活性肽 2
1.1.2 细胞 2
1.1.3 主要试剂及器材 3
1.2 实验方法 3
1.2.1 实验用细胞获取与培养 3
1.2.2 单位孔细胞浓度测验 4
1.2.3 多肽刺激 4
1.2.4 MTT试验 4
2 结果与分析 5
2.1 单位孔细胞浓度测验结果 5
2.2 多肽对不同种类细胞的影响 5
2.2.1 BP7对不同种类细胞活力的调节作用 5
2.2.2 BHP对不同种类细胞活力的调节作用 6
2.2.3 BP9对不同种类细胞活力的调节作用 7
2.2.4 BPPV活性肽对不同种类细胞活力的调节作用 7
2.2.5 BSPⅡ活性肽对不同种类细胞活力的调节作用 8
3 讨论 8
致谢 9
参考文献 10
表1细胞浓度与OD值的关系 5
表2 BP7对不同细胞活力的调节作用 6
表3 BHP对不同细胞活力的调节作用 6
表4 BP9对不同细胞活力的调 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
节作用 7
表5 BPPV对不同细胞活力的调节作用 7
表6 BSPII对不同细胞活力的调节作用 8
法氏囊活性肽对不同细胞活力的调节作用研究
引言
引言
众所周知，禽类免疫学对主流免疫学（人和哺乳动物免疫学）发展做出的最重要的贡献是区分了适应性免疫的两大主要武器（B淋巴细胞和T淋巴细胞）[1, 2]。法氏囊（Bursa of Fabricus, BF）最早于1621年由意大利解剖学家Hieronymus Fabricius发现，是目前世界上唯一公认的体液中枢免疫器官,是B细胞发育分化和成熟的场所。临床应用实践证明,法氏囊组织灭活疫苗无论对法氏囊病毒超强毒或变异株的免疫保护效果都是最好的,超过其它法氏囊病细胞苗、鸡胚苗[36]。猪痕脾淋苗的保护效果远远高于猪痕细胞苗,脾脏转移因子有明显的免疫增强效果[7],市场很火,这些说明禽类和哺乳动物的免疫器官中存在共同的促进免疫反应的活性分子。
目前临床上，各种疾病频频爆发，尤其是肿瘤性疫病[8]，有可能诱发动物机体的免疫抑制，不仅给养殖业造成了巨大的经济损失，而且造成了惨重的社会影响。肿瘤性疾病的发生，与肿瘤细胞增殖有着密切关系。目前，研究人员已在探索抑制肿瘤细胞增殖的新型药物或活性分子以期为防治肿瘤性疾病提供新的见解。法氏囊被人们确认为禽类特有的中枢淋巴器官,是B细胞的最早发生场所.B细胞由它迁移到外周淋巴器官定居和繁衍,执行免疫功能。鉴于法氏囊在免疫系统的重要性，作为很可能对肿瘤细胞产生显著作用的活性分子，研究体液免疫系统中法氏囊多肽对当前临床疫病防治具有重要意义。
MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3(4,5)dimethylthiahiazo (zy1)3,5di phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3(4，5二甲基噻唑2)2，5二苯基四氮唑溴盐，是一种黄颜色的染料。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在570nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强。本实验用以检测待测细胞活性强度。
为了研究法氏囊来源的活性肽抗肿瘤细胞增殖的作用，本研究以五种法氏囊活性肽为研究材料，对不同类型细胞活性的调节作用进行研究。
1 材料与方法
1．1 主要材料与试剂
1.1.1 法氏囊活性肽
五类实验用法氏囊活性肽，即BP7、BP9、BPPⅤ、BHP及BSPⅡ活性肽均由大学动物医学院预防方向传染病实验室提供。
1.1.2 细胞
四类实验用细胞，即BHK21细胞、PK15细胞、Vero细胞及SP2/0细胞均由大学动物医学院预防方向传染病实验室保存、提供。
1.1.3 主要试剂及器材
培养液：1640培养液，含20%牛血清及1%双抗，用于培养SP2/0细胞；含8%牛血清及1%双抗，用于培养PK15细胞。DMEM培养液，含10%牛血清及1%双抗，用于培养Vero细胞；含8%牛血清及1%双抗，用于培养BHK21细胞。
胰酶，配制剂量为胰蛋白 0.1g,NaHCO3 0.116g,葡萄糖 0.2g,KCl 0.08g,NaCl 1.6g EDTA 0.04g/200mL,PH值于7.2至7.4之间，主要用于消化细胞。
MTT试剂（3（4，5二甲基噻唑2）2，5二苯基四氮唑溴盐，是一种黄颜色染料。配成浓度为5mg/mL,须用PBS或生理盐水做溶剂。预先在50mL离心管加入20mLPBS，从中先吸取5001000μL PBS装入含MTT的小管中，吹打若干次后将其移入50mL离心管，然后再混匀。可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内。将MTT完全混匀后，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于20℃中。本实验中主要用于对细胞增殖及细胞活性进行测定，为该实验核心试剂。）
DMSO，二甲基亚砜，“万能溶剂”，该实验用于溶解活细胞内琥珀脱氢酶与MTT反应生成的甲瓒。
5%CO2、37℃恒温箱，4℃冷藏柜，液氮罐，离心机，摇床，酶联免疫检测仪及96孔板若干，等。
1.2 实验方法
1.2.1 实验用细胞获取与培养
1.2.1.1 冻存细胞复苏（贴壁细胞）
在实际操作中，冻存细胞要进行复苏，再培养传代。复苏细胞一般采用快速融化法，以保证细胞外结晶快速融化，以避免慢速融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶，损伤细胞。细胞复苏的主要操作步骤如下：
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 2
1 材料与方法 2
1．1 主要材料与试剂 2
1.1.1 法氏囊活性肽 2
1.1.2 细胞 2
1.1.3 主要试剂及器材 3
1.2 实验方法 3
1.2.1 实验用细胞获取与培养 3
1.2.2 单位孔细胞浓度测验 4
1.2.3 多肽刺激 4
1.2.4 MTT试验 4
2 结果与分析 5
2.1 单位孔细胞浓度测验结果 5
2.2 多肽对不同种类细胞的影响 5
2.2.1 BP7对不同种类细胞活力的调节作用 5
2.2.2 BHP对不同种类细胞活力的调节作用 6
2.2.3 BP9对不同种类细胞活力的调节作用 7
2.2.4 BPPV活性肽对不同种类细胞活力的调节作用 7
2.2.5 BSPⅡ活性肽对不同种类细胞活力的调节作用 8
3 讨论 8
致谢 9
参考文献 10
表1细胞浓度与OD值的关系 5
表2 BP7对不同细胞活力的调节作用 6
表3 BHP对不同细胞活力的调节作用 6
表4 BP9对不同细胞活力的调 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
节作用 7
表5 BPPV对不同细胞活力的调节作用 7
表6 BSPII对不同细胞活力的调节作用 8
法氏囊活性肽对不同细胞活力的调节作用研究
引言
引言
众所周知，禽类免疫学对主流免疫学（人和哺乳动物免疫学）发展做出的最重要的贡献是区分了适应性免疫的两大主要武器（B淋巴细胞和T淋巴细胞）[1, 2]。法氏囊（Bursa of Fabricus, BF）最早于1621年由意大利解剖学家Hieronymus Fabricius发现，是目前世界上唯一公认的体液中枢免疫器官,是B细胞发育分化和成熟的场所。临床应用实践证明,法氏囊组织灭活疫苗无论对法氏囊病毒超强毒或变异株的免疫保护效果都是最好的,超过其它法氏囊病细胞苗、鸡胚苗[36]。猪痕脾淋苗的保护效果远远高于猪痕细胞苗,脾脏转移因子有明显的免疫增强效果[7],市场很火,这些说明禽类和哺乳动物的免疫器官中存在共同的促进免疫反应的活性分子。
目前临床上，各种疾病频频爆发，尤其是肿瘤性疫病[8]，有可能诱发动物机体的免疫抑制，不仅给养殖业造成了巨大的经济损失，而且造成了惨重的社会影响。肿瘤性疾病的发生，与肿瘤细胞增殖有着密切关系。目前，研究人员已在探索抑制肿瘤细胞增殖的新型药物或活性分子以期为防治肿瘤性疾病提供新的见解。法氏囊被人们确认为禽类特有的中枢淋巴器官,是B细胞的最早发生场所.B细胞由它迁移到外周淋巴器官定居和繁衍,执行免疫功能。鉴于法氏囊在免疫系统的重要性，作为很可能对肿瘤细胞产生显著作用的活性分子，研究体液免疫系统中法氏囊多肽对当前临床疫病防治具有重要意义。
MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3(4,5)dimethylthiahiazo (zy1)3,5di phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3(4，5二甲基噻唑2)2，5二苯基四氮唑溴盐，是一种黄颜色的染料。检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在570nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强。本实验用以检测待测细胞活性强度。
为了研究法氏囊来源的活性肽抗肿瘤细胞增殖的作用，本研究以五种法氏囊活性肽为研究材料，对不同类型细胞活性的调节作用进行研究。
1 材料与方法
1．1 主要材料与试剂
1.1.1 法氏囊活性肽
五类实验用法氏囊活性肽，即BP7、BP9、BPPⅤ、BHP及BSPⅡ活性肽均由大学动物医学院预防方向传染病实验室提供。
1.1.2 细胞
四类实验用细胞，即BHK21细胞、PK15细胞、Vero细胞及SP2/0细胞均由大学动物医学院预防方向传染病实验室保存、提供。
1.1.3 主要试剂及器材
培养液：1640培养液，含20%牛血清及1%双抗，用于培养SP2/0细胞；含8%牛血清及1%双抗，用于培养PK15细胞。DMEM培养液，含10%牛血清及1%双抗，用于培养Vero细胞；含8%牛血清及1%双抗，用于培养BHK21细胞。
胰酶，配制剂量为胰蛋白 0.1g,NaHCO3 0.116g,葡萄糖 0.2g,KCl 0.08g,NaCl 1.6g EDTA 0.04g/200mL,PH值于7.2至7.4之间，主要用于消化细胞。
MTT试剂（3（4，5二甲基噻唑2）2，5二苯基四氮唑溴盐，是一种黄颜色染料。配成浓度为5mg/mL,须用PBS或生理盐水做溶剂。预先在50mL离心管加入20mLPBS，从中先吸取5001000μL PBS装入含MTT的小管中，吹打若干次后将其移入50mL离心管，然后再混匀。可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内。将MTT完全混匀后，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于20℃中。本实验中主要用于对细胞增殖及细胞活性进行测定，为该实验核心试剂。）
DMSO，二甲基亚砜，“万能溶剂”，该实验用于溶解活细胞内琥珀脱氢酶与MTT反应生成的甲瓒。
5%CO2、37℃恒温箱，4℃冷藏柜，液氮罐，离心机，摇床，酶联免疫检测仪及96孔板若干，等。
1.2 实验方法
1.2.1 实验用细胞获取与培养
1.2.1.1 冻存细胞复苏（贴壁细胞）
在实际操作中，冻存细胞要进行复苏，再培养传代。复苏细胞一般采用快速融化法，以保证细胞外结晶快速融化，以避免慢速融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶，损伤细胞。细胞复苏的主要操作步骤如下：
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