猪细小病毒vp2蛋白间接elisa方法的建立及初步应用
猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV），主要引起以母猪流产、死胎、弱胎、木乃伊胎为主的母猪繁殖障碍疾病，也会引起仔猪的死亡。本实验利用实验室所纯化和保存的VP2蛋白，优化建立间接ELISA方法。本研究所采用的VP2的蛋白浓度为1.43mg/mL，最佳蛋白包被浓度2μg每孔，4℃过夜，将待测血清以200倍的稀释，一抗孵育时间设定为30min，二抗的稀释倍数为10000倍并孵育30min。检测的临界值为0.278，即大于0.278为阳性。本研究的批内、批间实验的变异系数都小于10%，重复性很强；与商品化试剂盒的符合率阴性结果为90.70%，阳性结果为97.82%，总符合率为95.70%。敏感性、特异性较好。本研究优化建立的间接ELISA方法操作方便，重复性、敏感性、特异性好，对PPV疫苗免疫效果评价和感染血清抗体检测均具有现实可行的意义。
目录
摘要 2
关键词 2
Abstract 2
Keyword 2
引言 2
1材料与方法 3
1.1主要的仪器与试剂 3
1.1.1主要仪器 3
1.1.2主要试剂 3
1.2方法 3
1.2.1血清样本的分离 3
1.2.2测样本的猪细小病毒抗体 3
1.2.3测定实验室保存的VP2蛋白的浓度 4
1.2.4用已知浓度的VP2蛋白包被空白板子备用 4
1.2.5选定最佳的蛋白包被浓度 4
1.2.6确定血清的最佳稀释倍数 4
1.2.7研究一抗孵育时间长短对试验结果的影响 5
1.2.8测定本研究方法的临界值 5
1.2.9做批内、批间试验，测定变异系数 5
1.2.10计算符合率 6
1.2.11地区血清样本的检测 6
2结果 6
2.1实验室保存的VP2蛋白的浓度 6
2.2最佳的蛋白包被浓度的确定 6
2.3最佳血清稀释倍数的确定 6
2.4一抗孵育时间长短对试验结果的影响 8
2.5临界值的确定 8
2.6 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
重复性实验结果 8
2.7建立的间接ELISA方法的符合率 9
2.8地区血清样本的检测结果 9
3讨论 9
致谢 10
参考文献 10
猪细小病毒VP2蛋白间接ELISA方法的建立及初步应用
引言
猪细小病毒病（Porcine parvovirus infection）是由猪细小病毒（porcine parvovirus，PPV）引起的一种以仔猪多系统衰竭综合征和母猪繁殖障碍综合征为主的疾病，常常引起母猪的流产以及新生仔猪的死亡。猪细小病毒病的典型临床表现为母猪发生流产、死胎、木乃伊胎、畸形胎、弱胎以及产仔数不足和母猪不育等繁殖障碍[1, 2]。除此之外，朱细小病毒病也会引起其他的一些非典型病症，如一些皮肤病、腹泻等[3]。如今，许多的大型养殖场并不重视对猪细小病毒病的预防，使得该病常与其他病原如猪圆环病毒（PCV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、伪狂犬病毒（PRV）等发生混合感染而致病[4, 5]，从而造成巨大的经济损失。因此，加强对PPV的诊断技术的研究和开发是非常有必要的，对于控制猪细小病毒病具有重要意义。
猪细小病毒病最早是于1966年在英国被人所发现，后来，人们相继在日本、美国、丹麦、澳大利亚等地报道了该病[6]。在中国，我们在20世纪80年代开始分离出PPV[7]，到目前为止，该病以及广泛分布于世界各地。PPV属于细小病毒科细小病毒属成员，是无囊膜的单股线状DNA病毒，直径约为1822nm，它的全长大小约为5.0kb，主要的开放阅读框架（ORF）有2个，其中，在3’端的ORF主要编码VP1、VP2、VP3三个结构蛋白，而5’端的ORF则是编码NS1、NS2、NS3三个非结构蛋白[8, 9]。在这些蛋白中，构成病毒粒子的主要是VP2蛋白，VP2具有良好的免疫原性，可以有效地刺激机体产生强烈的免疫应答[10, 11]。正是因为如此，本研究借助于实验室所保存的VP2蛋白建立了间接ELISA方法来诊断猪细小病毒病。PPV除了正常的型外，也存在抗原变异株，这也是造成PPV免疫失败的一个重要原因[12]。
到目前为止，世界各地已经建立了多种诊断猪细小病毒病的实验室方法，主要为血凝和血凝抑制试验（HA/HI）、荧光抗体技术（FAT）和中和试验等[13]。但是，这些传统方法费时费力，特异性以及敏感性相对较差。用间接ELISA试验则操作方便，准确性、敏感性、特异性强，成本较低，而且还易于标准化。因此，ELISA方法已经成为运用最广泛发展速度最快的实验室诊断方法了。本研究就是在这样的前提下，利用实验室所保存的VP2蛋白建立了能快速检测猪细小病毒的间接ELISA方法，从而为快速有效诊断猪细小病毒病提供了一种简便、敏感的方法[14]。
1材料与方法
1.1主要的仪器与试剂
1.1.1主要仪器
酶标仪：BIOTEK ELX800全自动酶标仪，由美国BIOTEK公司所生产，从泽泉国际集团上海泽权仪器设备有限公司购入；核酸蛋白浓度测定仪D30：购于Eppendorf；电脑：联想；离心机，购于Eppendorf；超净工作台：购自于AIRTECH；CO2培养箱：购于南京宝诚生物技术有限公司；电子天平：购于上海良平仪器仪表有限公司；超微量移液器：包括2.5 μL，10 μL，100 μL，200 μL，1000 μL，购于Eppendorf；多样品组织研磨机：购于上海净信实业发展有限公司。
1.1.2主要试剂
VP2蛋白由本实验室纯化并保存；牛血清白蛋白：购于Roche；猪细小病毒ELISA抗体检测试剂盒：购于武汉科前生物股份有限公司；无水碳酸钠、碳酸氢钠：购于上海凌峰化学试剂有限公司；磷酸氢二钠、氯化钠、磷酸氢二钾：购于西陇化工股份有限公司；20x的PBSTween Solution（125mL）：购于Boehringer ingelheim；二抗：由大学传染病实验室分离并保存。实验所用血样：待检的血清由实验室提供，主要来自于江苏苏北地区（盐城、泰州等）。
1.2方法
1.2.1血清样本的分离
将送检的样本从具有抗凝剂的注射器中分离出来，分装在1.5mL的离心管中，没有血清析出的样本，可将其放置于4℃静置后，12000r/min离心1min后取上层血清。
目录
摘要 2
关键词 2
Abstract 2
Keyword 2
引言 2
1材料与方法 3
1.1主要的仪器与试剂 3
1.1.1主要仪器 3
1.1.2主要试剂 3
1.2方法 3
1.2.1血清样本的分离 3
1.2.2测样本的猪细小病毒抗体 3
1.2.3测定实验室保存的VP2蛋白的浓度 4
1.2.4用已知浓度的VP2蛋白包被空白板子备用 4
1.2.5选定最佳的蛋白包被浓度 4
1.2.6确定血清的最佳稀释倍数 4
1.2.7研究一抗孵育时间长短对试验结果的影响 5
1.2.8测定本研究方法的临界值 5
1.2.9做批内、批间试验，测定变异系数 5
1.2.10计算符合率 6
1.2.11地区血清样本的检测 6
2结果 6
2.1实验室保存的VP2蛋白的浓度 6
2.2最佳的蛋白包被浓度的确定 6
2.3最佳血清稀释倍数的确定 6
2.4一抗孵育时间长短对试验结果的影响 8
2.5临界值的确定 8
2.6 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
重复性实验结果 8
2.7建立的间接ELISA方法的符合率 9
2.8地区血清样本的检测结果 9
3讨论 9
致谢 10
参考文献 10
猪细小病毒VP2蛋白间接ELISA方法的建立及初步应用
引言
猪细小病毒病（Porcine parvovirus infection）是由猪细小病毒（porcine parvovirus，PPV）引起的一种以仔猪多系统衰竭综合征和母猪繁殖障碍综合征为主的疾病，常常引起母猪的流产以及新生仔猪的死亡。猪细小病毒病的典型临床表现为母猪发生流产、死胎、木乃伊胎、畸形胎、弱胎以及产仔数不足和母猪不育等繁殖障碍[1, 2]。除此之外，朱细小病毒病也会引起其他的一些非典型病症，如一些皮肤病、腹泻等[3]。如今，许多的大型养殖场并不重视对猪细小病毒病的预防，使得该病常与其他病原如猪圆环病毒（PCV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、伪狂犬病毒（PRV）等发生混合感染而致病[4, 5]，从而造成巨大的经济损失。因此，加强对PPV的诊断技术的研究和开发是非常有必要的，对于控制猪细小病毒病具有重要意义。
猪细小病毒病最早是于1966年在英国被人所发现，后来，人们相继在日本、美国、丹麦、澳大利亚等地报道了该病[6]。在中国，我们在20世纪80年代开始分离出PPV[7]，到目前为止，该病以及广泛分布于世界各地。PPV属于细小病毒科细小病毒属成员，是无囊膜的单股线状DNA病毒，直径约为1822nm，它的全长大小约为5.0kb，主要的开放阅读框架（ORF）有2个，其中，在3’端的ORF主要编码VP1、VP2、VP3三个结构蛋白，而5’端的ORF则是编码NS1、NS2、NS3三个非结构蛋白[8, 9]。在这些蛋白中，构成病毒粒子的主要是VP2蛋白，VP2具有良好的免疫原性，可以有效地刺激机体产生强烈的免疫应答[10, 11]。正是因为如此，本研究借助于实验室所保存的VP2蛋白建立了间接ELISA方法来诊断猪细小病毒病。PPV除了正常的型外，也存在抗原变异株，这也是造成PPV免疫失败的一个重要原因[12]。
到目前为止，世界各地已经建立了多种诊断猪细小病毒病的实验室方法，主要为血凝和血凝抑制试验（HA/HI）、荧光抗体技术（FAT）和中和试验等[13]。但是，这些传统方法费时费力，特异性以及敏感性相对较差。用间接ELISA试验则操作方便，准确性、敏感性、特异性强，成本较低，而且还易于标准化。因此，ELISA方法已经成为运用最广泛发展速度最快的实验室诊断方法了。本研究就是在这样的前提下，利用实验室所保存的VP2蛋白建立了能快速检测猪细小病毒的间接ELISA方法，从而为快速有效诊断猪细小病毒病提供了一种简便、敏感的方法[14]。
1材料与方法
1.1主要的仪器与试剂
1.1.1主要仪器
酶标仪：BIOTEK ELX800全自动酶标仪，由美国BIOTEK公司所生产，从泽泉国际集团上海泽权仪器设备有限公司购入；核酸蛋白浓度测定仪D30：购于Eppendorf；电脑：联想；离心机，购于Eppendorf；超净工作台：购自于AIRTECH；CO2培养箱：购于南京宝诚生物技术有限公司；电子天平：购于上海良平仪器仪表有限公司；超微量移液器：包括2.5 μL，10 μL，100 μL，200 μL，1000 μL，购于Eppendorf；多样品组织研磨机：购于上海净信实业发展有限公司。
1.1.2主要试剂
VP2蛋白由本实验室纯化并保存；牛血清白蛋白：购于Roche；猪细小病毒ELISA抗体检测试剂盒：购于武汉科前生物股份有限公司；无水碳酸钠、碳酸氢钠：购于上海凌峰化学试剂有限公司；磷酸氢二钠、氯化钠、磷酸氢二钾：购于西陇化工股份有限公司；20x的PBSTween Solution（125mL）：购于Boehringer ingelheim；二抗：由大学传染病实验室分离并保存。实验所用血样：待检的血清由实验室提供，主要来自于江苏苏北地区（盐城、泰州等）。
1.2方法
1.2.1血清样本的分离
将送检的样本从具有抗凝剂的注射器中分离出来，分装在1.5mL的离心管中，没有血清析出的样本，可将其放置于4℃静置后，12000r/min离心1min后取上层血清。
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