应用gfp融合技术鉴定猪链球菌小rnarss28编码的多肽及其翻译起始位点

目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1菌株、质粒 2
1.1.2试剂、培养基2
1.2方法 3
1.2.1 PCR扩增目的片段与融合PCR3
1.2.2构建并鉴定重组质粒rss28：：GFP3
1.2.3猪链球菌P1/7感受态的制备4
1.2.4将重组质粒电转化感受态细胞4
1.2.5含重组质粒P1/7筛选与鉴定4
1.2.6 Western Blot检测rss28：：GFP融合蛋白4
1.2.7碱基定点缺失突变技术5
1.2.8 Western Blot鉴定rss28翻译起始位点5
2结果5
2.1 rss28与GFP融合6
2.2 重组质粒rss28：：GFP的构建与鉴定6
2.3 Western Blot验证rss28：：GFP融合蛋白6
2.4 突变质粒rss28::GFPm1、rss28::GFPm2和rss28::GFPm3的构建与鉴定7
2.5 Western Blot确定rss28翻译起始位点7
3讨论 8
致谢8
参考文献9
应用GFP融合技术鉴定猪链球菌小RNA rss28编码的多肽 及其翻译起始位点
动物医学 赖丽颖
引言
猪链球菌（Streptococcus suis）是一种革兰氏阳性菌，一般分为33个血清型，其中2型分离率最高，致病性也最强，可以引起猪的急性败血症、脑膜炎、关节炎及急性死亡，也可导致生猪从业人员感染和死亡，是一种重要的人畜共患病原菌[1, 2]。猪链球茵病不仅给养猪业的健康发展造成极大的危害，还严重威胁着人类的公共卫生安全，已经引起高度重视。
猪链球菌可精细地调控毒力因子的表达。近来研究发现，细菌小RNA（small RNAs，sRNAs）可作为细菌毒力调控关键因子[35] *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072# 
。sRNAs常见的作用方式是与靶位基因mRNA结合，抑制靶位mRNA翻译或同时影响靶位mRNA稳定性导致其降解，大部分这类小RNA被称为核糖核酸调节子（riboregulator）[3, 6, 7]，通常不编码蛋白质。然而，最近文献表明，sRNAs不仅可以作为核糖核酸调节子参与基因调控，还可以编码多肽，行使双功能[8] 。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、质粒
猪链球菌P1/7毒力株分离自患脑膜炎病猪。本实验中猪链球菌在THB（ToddHewitt broth, Oxoid）与THA（ToddHewitt agar）培养基中培养，培养温度为37℃；大肠杆菌在LB（LuriaBertani，Becton Dickinson）培养基中培养，培养温度为37℃；在必要情况下，培养基需要加入抗生素。对于猪链球菌，培养基壮观霉素（Spc）浓度为100 μg/mL；对于大肠杆菌，培养基Spc浓度为50 μg/mL，卡那霉素（Kan）浓度为100 μg/mL；质粒信息见表1。
表1 质粒信息
质粒名称
质粒特性
来源
pEGFP/N2
可编码GFP蛋白
BD Biosciences Clontech
pSET4S
大肠杆菌猪链球菌穿梭质粒；含lacZ基因； pG + host3复制元件；Spc抗性；
从Dr.Tsutomu Sekizaki Daisuke Takamatsu获得
Rss28::GFP
以pSET4S为基础构建的重组质粒，其中含有
rss28与GFP融合片段；Spc抗性
本试验构建
Rss28::GFPm1
以rss28::GFP质粒为基础，可能的翻译起始位点后的A碱基缺失
本试验构建
Rss28::GFPm2
以rss28::GFP质粒为基础，可能的翻译起始位点后的A碱基缺失
本实验构建
Rss28::GFPm3
以rss28::GFP质粒为基础，可能的翻译起始位点后的C碱基缺失
本实验构建
1.1.2 试剂、培养基
PstI与BamHI两种限制性内切酶、T4连接酶、核酸Marker、酶切产物回收试剂盒等购自Takara公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自OMEGA biotek公司；碱基定点突变试剂盒购自Agilent Technologies公司；GFP单克隆抗体购自TransGen Biotech公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗鼠抗体购自Boster公司；Western blot化学显色试剂盒购自Thermo Scientific公司；其他试剂均为国产分析纯；引物合成由北京鼎国昌盛公司完成；测序由上海桑尼生物科技公司完成；培养基由本实验室配制。
1.2 方法
1.2.1 PCR扩增目的片段与融合PCR
分别根据NCBI数据库中猪链球菌毒力株P1/7 rss28基因序列、绿色荧光蛋白ORF基因序列用Oligo 6软件设计两对引物。引物序列见表2。其中引物A与B用于扩增长度为369bp的rss28片段（rss28上下游为引物），引物C与D用于扩增长度为717bp的GFP片段（去除其起始密码子ATG）。引物A与D 5端分别添加酶切位点PstI与BamHI，引物C 5端需要添加引物B的反向互补序列，以便rss28和GFP片段融合。
表2 rss28起始密码子片段与GFP片段PCR扩增引物序列
引物名称
引物序列(53)
A
ATATGCCTGCAGAAGCAGGAGCTGCACCAATCT
B
AGACCATGGTAAAGAGAGAAA

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