水包油型乳剂口蹄疫疫苗的制备及免疫效力的测定
口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的人畜共患的一种急性、热性、高度接触性传染病，给畜牧业带来很大的经济损失。选用优质的疫苗对动物进行预防免疫是控制该病最好方法。为了改进现有口蹄疫疫苗，增强疫苗的免疫效果，减少疫苗的毒副作用，本实验通过制备EAS水包油纳米乳，将该纳米乳与口蹄疫抗原混合，制备优质安全的口蹄疫疫苗。EAS纳米乳疫苗制备工艺简单、稳定性好、黏度低、符合疫苗制作要求。EAS纳米乳口蹄疫疫苗免疫Balb/c小鼠，用液相阻断ELISA检测小鼠血清抗体阳性率。结果显示，与ISA206佐剂口蹄疫疫苗相比，EAS纳米乳口蹄疫疫苗免疫效果显著，具有较高的抗体诱导水平。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1引言 1
1 材料与方法2
1.1实验材料 2
1.2实验方法 2
1.2.1 EAS纳米乳口蹄疫疫苗的制备2
1.2.2 EAS纳米乳口蹄疫疫苗的质量评价3
1.2.3 EAS纳米乳口蹄疫疫苗免疫动物抗体水平检测3
2 结果与分析4
2.1 EAS纳米乳口蹄疫疫苗的质量评价4
2.2 EAS纳米乳口蹄疫疫苗免疫动物抗体水平检测5
3 讨论6
致谢7
参考文献7
水包油型乳剂口蹄疫疫苗的制备及免疫效力的测定
引言
口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的人畜共患的一种急性、热性、高度接触性传染病，其临诊特征是在口腔黏膜、四肢下端及乳房等皮肤处形成水疱和烂斑，成年动物多取良性经过，幼龄动物多因心肌受损，死亡率较高。该病传播迅速，流行广泛，世界动物卫生组织将本病列为A类动物疫病之首。国际贸易日趋增加，给该病的预防和控制增加了难度，因此世界各国对该病的防治研究非常重视，其中疫苗是该病的主要防治手段之一[1]。
佐剂作为一种抗原辅助剂，是一种加入在疫苗中可以增强机体免疫应答水平的物质，佐剂通过直接对免疫系统作用，或者通过修饰抗原的药物动力学特性来增加机体对抗原的应答从而增加抗原与免疫系统的相互作用，并且可以节约抗原的用量，因此成为疫苗研究的热点[2]。
乳剂是由水相、油相 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
和表面活性剂混合组成分散体系，通常将粒径在纳米级的乳剂称为纳米乳剂。纳米乳具有粒径小且均匀，易于制备，稳定性和流动性良好，易于注射等优点，可作为药物载体应用于多种药物制剂中以达到更好的吸收效果[3]。同时纳米乳剂也可作为疫苗佐剂，增强疫苗的效果[4]。纳米乳作为疫苗佐剂具有以下优势：（1）保护抗原（2）促进疫苗抗原在机体的吸收，提高生物利用率（3）可降低疫苗的刺激性和毒副作用（4）疫苗分散均匀，稳定性好，适合生产（5）可降低抗原的用量，降低疫苗生产成本[5]。纳米乳佐剂增强疫苗免疫能力的机制尚未研究清楚，国内外目前主要研究的有以下几个方面：（1）诱导机体产生高水平抗体（2）促进抗原提呈（3）加速淋巴细胞的分化成熟（4）介导CD4+T细胞反应并分泌大量细胞因子（5）增强CD8+T细胞的细胞毒作用[6]。
纳米乳是由油相、水相、表面活性剂按适当的比例混合而成的，油相、表面活性剂的选择至关重要，直接关系到能否成乳。油相的极性和油相的链长影响纳米乳的稳定性，用低极性、低水溶性的油相形成的纳米乳比较稳定。表面活性剂的选择主要考虑亲水亲油平衡值（HLB），HLB越高，亲水性越强，HLB越低，亲油性越强，不同HLB值的表面活性剂形成不同类型的乳剂，HLB值在4.0~6.0之间容易形成油包水型乳剂，HLB值在8.0~16.0之间易形成水包油型乳剂，复合型的表面活性剂比单一表面活性剂效果更好[7]。本试验是在油相和表面活性剂前期筛选完成的基础上进行试验。
本研究选用纳米乳作为口蹄疫抗原的佐剂制备口蹄疫疫苗，首先筛选纳米乳剂的配方和合成比例，获得物理性质适合疫苗注射并能够包被口蹄疫抗原的纳米乳剂，将固定剂量纳米乳剂和固定剂量口蹄疫抗原混合，制备出以纳米乳剂为佐剂的口蹄疫疫苗。检测纳米乳疫苗的理化性质，在标准体重的小鼠背部皮下注射该疫苗，于规定天数对小鼠眼底静脉丛采血，液相阻断ELISA检测小鼠血清抗体阳性率，检测纳米乳疫苗的免疫效力。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 病毒抗原
O型口蹄疫病毒抗原，由内蒙古金宇集团提供。
1.1.2 实验动物
Balb/c小鼠，雌性，4~6周龄清洁级，体重18~22g，由扬州大学比较医学研究中心提供。
1.1.3 主要试剂和器材
1.1.3.1 纳米乳配置所需试剂
Tween80，Span80，Carbopol(美国sigma公司)，ISA206（法国SEPPIC公司），角鲨烷（南京天邦生物股份有限公司），96孔血凝板（北京华越洋生物有限公司）。
1.1.3.2 实验主要仪器
口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA试剂盒（中国农业科学院兰州兽医研究所），FA2004电子分析天平（上海磐兴机械设备有限公司），台式离心机（德国艾本德股份公司），
OS20Pro顶置式电子搅拌器（美国美国赛洛捷克有限公司），高压乳匀机（ATS工业系统有限公司），马尔文激光粒径分析仪，Mastersizer 2000软件（英国马尔文仪器有限公司），AIRTECH BCM1000A 超净工作台（江苏苏净安泰空气技术有限公司），可见光分光光度计（上海图新电子科技有限公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 EAS纳米乳口蹄疫疫苗的制备
按照一定比例将Tween80加入到200 mL的容量瓶中，加少许柠檬酸柠檬酸钠缓冲溶液（pH6.5）溶解Tween80；将一定比例的Span80溶解在角鲨烷中，加入容量瓶；用柠檬酸柠檬酸钠缓冲溶液定容至200 mL并混匀。加入卡波姆，摇晃混合后以10000 rpm乳化10 min，制成粗乳，再将该粗乳通过高压均质机1100 bar压力下循环6次，进行纳米化，制得EAS纳米乳。在超净台中，将制备好的EAS纳米乳用0.22um的小滤器过滤除菌，操作过程严格遵循无菌操作。过滤好后，将已经制备好的EAS纳米乳与适当浓度的口蹄疫抗原按1:1比例缓慢混合，一边缓慢加入口蹄疫抗原一边摇晃，确保充分混匀。
1.2.2 EAS纳米乳口蹄疫疫苗的质量评价
1.2.2.1 EAS纳米乳疫苗的外观观察，pH测定
外观：肉眼观察纳米乳疫苗颜色、流动性等物理状态。
pH测定：采用pH试纸，用玻璃棒滴一滴纳米乳疫苗，半秒后比对标准试纸颜色判断pH。
1.2.2.2 EAS纳米乳口蹄疫疫苗的结构类型鉴定
将一滴制备好的纳米乳疫苗滴入纯水中，若乳滴迅速分散，与水混溶，则该纳米乳疫苗为水包油型（O/W型）；若乳滴分散较慢，在水中呈云雾状，则该纳米乳疫苗为水包油包水型（W/O/W型）；若乳滴在水面散开，浮于水面上，则该纳米乳疫苗为油包水型（W/O型）[8]。
1.2.2.3 EAS纳米乳口蹄疫疫苗的颗粒大小检测
激光粒径分析仪检测：开启Mastersizer 2000软件，设置相关系数，初始化结束后，将EAS纳米乳疫苗慢慢加入湿法进样器，加至可测量浓度，测得平均粒径，得到粒径分布图。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1引言 1
1 材料与方法2
1.1实验材料 2
1.2实验方法 2
1.2.1 EAS纳米乳口蹄疫疫苗的制备2
1.2.2 EAS纳米乳口蹄疫疫苗的质量评价3
1.2.3 EAS纳米乳口蹄疫疫苗免疫动物抗体水平检测3
2 结果与分析4
2.1 EAS纳米乳口蹄疫疫苗的质量评价4
2.2 EAS纳米乳口蹄疫疫苗免疫动物抗体水平检测5
3 讨论6
致谢7
参考文献7
水包油型乳剂口蹄疫疫苗的制备及免疫效力的测定
引言
口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的人畜共患的一种急性、热性、高度接触性传染病，其临诊特征是在口腔黏膜、四肢下端及乳房等皮肤处形成水疱和烂斑，成年动物多取良性经过，幼龄动物多因心肌受损，死亡率较高。该病传播迅速，流行广泛，世界动物卫生组织将本病列为A类动物疫病之首。国际贸易日趋增加，给该病的预防和控制增加了难度，因此世界各国对该病的防治研究非常重视，其中疫苗是该病的主要防治手段之一[1]。
佐剂作为一种抗原辅助剂，是一种加入在疫苗中可以增强机体免疫应答水平的物质，佐剂通过直接对免疫系统作用，或者通过修饰抗原的药物动力学特性来增加机体对抗原的应答从而增加抗原与免疫系统的相互作用，并且可以节约抗原的用量，因此成为疫苗研究的热点[2]。
乳剂是由水相、油相 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
和表面活性剂混合组成分散体系，通常将粒径在纳米级的乳剂称为纳米乳剂。纳米乳具有粒径小且均匀，易于制备，稳定性和流动性良好，易于注射等优点，可作为药物载体应用于多种药物制剂中以达到更好的吸收效果[3]。同时纳米乳剂也可作为疫苗佐剂，增强疫苗的效果[4]。纳米乳作为疫苗佐剂具有以下优势：（1）保护抗原（2）促进疫苗抗原在机体的吸收，提高生物利用率（3）可降低疫苗的刺激性和毒副作用（4）疫苗分散均匀，稳定性好，适合生产（5）可降低抗原的用量，降低疫苗生产成本[5]。纳米乳佐剂增强疫苗免疫能力的机制尚未研究清楚，国内外目前主要研究的有以下几个方面：（1）诱导机体产生高水平抗体（2）促进抗原提呈（3）加速淋巴细胞的分化成熟（4）介导CD4+T细胞反应并分泌大量细胞因子（5）增强CD8+T细胞的细胞毒作用[6]。
纳米乳是由油相、水相、表面活性剂按适当的比例混合而成的，油相、表面活性剂的选择至关重要，直接关系到能否成乳。油相的极性和油相的链长影响纳米乳的稳定性，用低极性、低水溶性的油相形成的纳米乳比较稳定。表面活性剂的选择主要考虑亲水亲油平衡值（HLB），HLB越高，亲水性越强，HLB越低，亲油性越强，不同HLB值的表面活性剂形成不同类型的乳剂，HLB值在4.0~6.0之间容易形成油包水型乳剂，HLB值在8.0~16.0之间易形成水包油型乳剂，复合型的表面活性剂比单一表面活性剂效果更好[7]。本试验是在油相和表面活性剂前期筛选完成的基础上进行试验。
本研究选用纳米乳作为口蹄疫抗原的佐剂制备口蹄疫疫苗，首先筛选纳米乳剂的配方和合成比例，获得物理性质适合疫苗注射并能够包被口蹄疫抗原的纳米乳剂，将固定剂量纳米乳剂和固定剂量口蹄疫抗原混合，制备出以纳米乳剂为佐剂的口蹄疫疫苗。检测纳米乳疫苗的理化性质，在标准体重的小鼠背部皮下注射该疫苗，于规定天数对小鼠眼底静脉丛采血，液相阻断ELISA检测小鼠血清抗体阳性率，检测纳米乳疫苗的免疫效力。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 病毒抗原
O型口蹄疫病毒抗原，由内蒙古金宇集团提供。
1.1.2 实验动物
Balb/c小鼠，雌性，4~6周龄清洁级，体重18~22g，由扬州大学比较医学研究中心提供。
1.1.3 主要试剂和器材
1.1.3.1 纳米乳配置所需试剂
Tween80，Span80，Carbopol(美国sigma公司)，ISA206（法国SEPPIC公司），角鲨烷（南京天邦生物股份有限公司），96孔血凝板（北京华越洋生物有限公司）。
1.1.3.2 实验主要仪器
口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA试剂盒（中国农业科学院兰州兽医研究所），FA2004电子分析天平（上海磐兴机械设备有限公司），台式离心机（德国艾本德股份公司），
OS20Pro顶置式电子搅拌器（美国美国赛洛捷克有限公司），高压乳匀机（ATS工业系统有限公司），马尔文激光粒径分析仪，Mastersizer 2000软件（英国马尔文仪器有限公司），AIRTECH BCM1000A 超净工作台（江苏苏净安泰空气技术有限公司），可见光分光光度计（上海图新电子科技有限公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 EAS纳米乳口蹄疫疫苗的制备
按照一定比例将Tween80加入到200 mL的容量瓶中，加少许柠檬酸柠檬酸钠缓冲溶液（pH6.5）溶解Tween80；将一定比例的Span80溶解在角鲨烷中，加入容量瓶；用柠檬酸柠檬酸钠缓冲溶液定容至200 mL并混匀。加入卡波姆，摇晃混合后以10000 rpm乳化10 min，制成粗乳，再将该粗乳通过高压均质机1100 bar压力下循环6次，进行纳米化，制得EAS纳米乳。在超净台中，将制备好的EAS纳米乳用0.22um的小滤器过滤除菌，操作过程严格遵循无菌操作。过滤好后，将已经制备好的EAS纳米乳与适当浓度的口蹄疫抗原按1:1比例缓慢混合，一边缓慢加入口蹄疫抗原一边摇晃，确保充分混匀。
1.2.2 EAS纳米乳口蹄疫疫苗的质量评价
1.2.2.1 EAS纳米乳疫苗的外观观察，pH测定
外观：肉眼观察纳米乳疫苗颜色、流动性等物理状态。
pH测定：采用pH试纸，用玻璃棒滴一滴纳米乳疫苗，半秒后比对标准试纸颜色判断pH。
1.2.2.2 EAS纳米乳口蹄疫疫苗的结构类型鉴定
将一滴制备好的纳米乳疫苗滴入纯水中，若乳滴迅速分散，与水混溶，则该纳米乳疫苗为水包油型（O/W型）；若乳滴分散较慢，在水中呈云雾状，则该纳米乳疫苗为水包油包水型（W/O/W型）；若乳滴在水面散开，浮于水面上，则该纳米乳疫苗为油包水型（W/O型）[8]。
1.2.2.3 EAS纳米乳口蹄疫疫苗的颗粒大小检测
激光粒径分析仪检测：开启Mastersizer 2000软件，设置相关系数，初始化结束后，将EAS纳米乳疫苗慢慢加入湿法进样器，加至可测量浓度，测得平均粒径，得到粒径分布图。
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