瘤胃原虫菌群结构及其在瘤胃中丰度变化的规律
为探讨瘤胃原虫菌群结构及其在瘤胃中丰度变化的规律。选用12只安装了永久性瘤胃瘘管的山羊为试验动物，随机分为两组，分别饲喂全草料和高精料2种日粮，7周后采集瘤胃内容物，测定瘤胃液pH值、VFA指标，采用荧光定量PCR定量瘤胃原虫，采用高通量测序分析瘤胃原虫区系结构。结果显示随日粮中精料比值提高，瘤胃pH显著降低（P＜0.05）；瘤胃液中乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸和总挥发性脂肪酸浓度均显著增加（P＜0.05），而乙酸与丙酸比降低。荧光定量PCR结果表明，随精料比值提高，瘤胃纤毛虫数量增加。18S rRNA基因测序结果表明，头毛科中内毛属和等毛科中的等毛属数量增加（P＜0.05），头毛属数量下降（P＜0.05）。瘤胃原虫受日粮影响很大，菌群结构发生改变，纤毛虫的数量增加。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1 试验动物及试验设计 2
1.2样品采集2
1.3 DNA提取2
1.4 RealTimePCR3
1.5 Miseq测序和分析3
1.6挥发性脂肪酸测定3
1.7数据分析3
2结果与分析3
2.1不同日粮对瘤胃内环境影响 3
2.2原虫丰度在瘤胃内随时间变化规律4
2.3不同日粮对原虫菌群结构的影响4
3讨论5
致谢6
参考文献6
瘤胃原虫菌群结构及其在瘤胃中丰度变化的规律
动物科学 付乐
引言
反刍动物瘤胃是一个复杂的微生态系统，饲料的消化代谢依赖于微生物的活动[1,2]。瘤胃微生物参与饲料营养成分转化成能够被动物机体所利用物质这一过程，因此瘤胃微生物菌群对宿主机体健康和动物产品的形成至关重要。瘤胃中参与饲料降解过程的有三大类微生物菌群，即细菌、原虫和真菌。其中，原虫是个体最大、生物量比重最高的菌群，在瘤胃营养物质代谢过程中具有重要作用[3]，具体表现为：其可以利用纤维素；改善蛋白质的品质；维持瘤胃pH趋于稳定；抗氧化等[4] *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
。除此之外，瘤胃原虫与瘤胃细 菌、真菌之间复杂的互作关系对瘤胃代谢的影响也不容忽视，主要分为竞争和协同作用。一般认为，瘤胃原虫和细菌最明显的关系就是吞食与被吞食的竞争关系[5]。而瘤胃原虫与真菌之间则主要是协同效应。目前大部分研究表明，原虫和真菌间是负协同效应[6,7]，但高巍和孟庆翔（2003）的研究表明则它们之间存在正协同效应[8]。
瘤胃原虫的去留一直存在较大争议，同时瘤胃去原虫在生产中也较难实现。过去大部分试验肯定了全部驱除原虫对反刍动物营养物质代谢的积极作用。许多研究表明，去除原虫可增加瘤胃丙酸产量，丙酸是反刍动物葡萄糖的主要来源。随着研究的不断深入，原虫的正面效应也得到了进一步肯定。韩春艳等（2004）研究表明，部分驱除原虫可明显提高瘤胃发酵程度，其发酵水平优于全部驱除原虫[9]。卢德勋（2004）综合各种观点，提出通过控制瘤胃原虫种类和数目，可达到充分利用原虫的正面效应得目的，缩小其负面效应的新理论[10]。因此，通过合理调控瘤胃原虫的区系结构及种群密度，创造适宜的瘤胃内环境，是充分发挥原虫有利生理功能，提高反刍动物饲料利用率和生产性能的有效途径。为此，深入了解瘤胃原虫的菌群结构和变化规律，对合理调控瘤胃原虫有重要意义。
大量研究表明，日粮既可以影响原虫的数量，也能影响原虫菌群结构[11]。一般随日粮中精料的增加，瘤胃原虫数量会增多。当日粮中精饲料含量增长到50 %～60%时, 瘤胃内原虫数量最多[2]。但当精料浓度达到60 %以上时，原虫数量会下降甚至消失[12]。其次，日粮精粗比影响原虫中纤毛虫的组成，尤其对内毛虫的数量影响较大。在奶牛上，饲喂干草或牧草时，内毛虫数量占总数的40%90%。当日粮中添加精饲料时，内毛虫数量可达整个纤毛虫数量的90%98% [13]。此外，Ueda等（2003）研究发现，与采食日粮精粗比为35:65的奶牛相比，日粮精粗比为65:35的奶牛，内毛虫的数量显著提高（P<0.05）[14]。并且，随着日粮精粗比的提高，密毛属和均毛属数量也会显著增加，这可能是由于均毛属和密毛属能够优先利用可溶性糖的原因。
因此，通过调整日粮结构来调控反刍动物瘤胃原虫，是一个切实可行的方法。但是目前，有关纤毛虫种属变化的研究较少，且结果不尽相同。其中日粮对瘤胃原虫种属的影响结果因实验条件等不同，差异也很大。因此，有必要就日粮精粗比对原虫种属变化的影响作进一步的研究。本文拟运用荧光定量PCR、高通量测序等手段，监测不同日粮条件下以及不同时间点原虫在山羊瘤胃内的变化规律，同时检测原虫菌群结构的差异。
1.材料与方法
1.1试验动物及试验设计
试验动物为12头8月龄的安装有瘤胃屡管的健康公山羊。饲养于大学动物科技学院动物房，自由饮水。试验开始前，动物经历两个周的适应期，在适应期内自由采食干草和水。适应期后，12头山羊随机分为两组，全草组（Hay, 80%羊草+16%苜蓿，n=6）和高精料组（HG，36.5%小麦+20%玉米+15%豆粕+18%羊草+7%苜蓿，n=6）。两组动物的平均体重为28kg，没有显著性差异。高精料组山羊在试验开始的5天内，精料逐渐增加到75%，以便动物逐渐适应高精料。每头山羊每天采食900 g干物质。每天分别在早晨8:00和下午17:00饲喂。试验期为7个周。
1.2样品采集
在适应期的第二周，通过瘤胃瘘管，随机选取5头羊采集瘤胃内容物。采集时间点分别为饲喂前2 h、饲喂后0 h、2 h、4 h、6 h、8 h，6个时间点连续采集瘤胃内容物，20℃保存，备提DNA，进行定量分析原虫丰度。
12头山羊于试验期第50天早晨饲喂4小时后屠宰，采集瘤胃内容物和瘤胃液，20℃保存，备提DNA和测定挥发性脂肪酸。
1.3 DNA提取
DNA提取采用CTAB/酚氯仿异戊醇法。1 mL瘤胃内容物13000rpm，离心15 min，4℃。破碎细胞释放DNA采用Bead beat，FastPrep instrument (QBiogene)，2×60 s，speed 6.0。
1.4 realtime PCR
原虫定量采用引物如下。前引物：GCTTTCGWTGGTAGTGTATT；后引物：CTTGCCCTCYAATCGTWCT。应用的qPCR仪为Applied Biosystems 7900 RealTime PCR System (Applied Biosystems, California, USA)。qPCR试剂为SYBR? Green PCR Master Mix (ABI)。反应体系10 μL，引物浓度200 nmol/L，DNA模板浓度1~100 ng/μL。反应程序：50℃，2 min；95℃，10 min；接40个循环95℃，15 s；60℃，1 min。标准曲线由引物M13分别扩增两种甲烷菌的PCR产物制作的质粒制成。M13扩增产物经试剂盒纯化后用Qubit? 2.0 Fluorometer和Qubit TM dsDNA BR Assay Kits（Invitrogen）测定DNA浓度。拷贝数有如下公式计算：（amount × 6.022×1023）/（length × 1×109 × 650）。定量时采用103~108 系列浓度标准样品。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1 试验动物及试验设计 2
1.2样品采集2
1.3 DNA提取2
1.4 RealTimePCR3
1.5 Miseq测序和分析3
1.6挥发性脂肪酸测定3
1.7数据分析3
2结果与分析3
2.1不同日粮对瘤胃内环境影响 3
2.2原虫丰度在瘤胃内随时间变化规律4
2.3不同日粮对原虫菌群结构的影响4
3讨论5
致谢6
参考文献6
瘤胃原虫菌群结构及其在瘤胃中丰度变化的规律
动物科学 付乐
引言
反刍动物瘤胃是一个复杂的微生态系统，饲料的消化代谢依赖于微生物的活动[1,2]。瘤胃微生物参与饲料营养成分转化成能够被动物机体所利用物质这一过程，因此瘤胃微生物菌群对宿主机体健康和动物产品的形成至关重要。瘤胃中参与饲料降解过程的有三大类微生物菌群，即细菌、原虫和真菌。其中，原虫是个体最大、生物量比重最高的菌群，在瘤胃营养物质代谢过程中具有重要作用[3]，具体表现为：其可以利用纤维素；改善蛋白质的品质；维持瘤胃pH趋于稳定；抗氧化等[4] *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
。除此之外，瘤胃原虫与瘤胃细 菌、真菌之间复杂的互作关系对瘤胃代谢的影响也不容忽视，主要分为竞争和协同作用。一般认为，瘤胃原虫和细菌最明显的关系就是吞食与被吞食的竞争关系[5]。而瘤胃原虫与真菌之间则主要是协同效应。目前大部分研究表明，原虫和真菌间是负协同效应[6,7]，但高巍和孟庆翔（2003）的研究表明则它们之间存在正协同效应[8]。
瘤胃原虫的去留一直存在较大争议，同时瘤胃去原虫在生产中也较难实现。过去大部分试验肯定了全部驱除原虫对反刍动物营养物质代谢的积极作用。许多研究表明，去除原虫可增加瘤胃丙酸产量，丙酸是反刍动物葡萄糖的主要来源。随着研究的不断深入，原虫的正面效应也得到了进一步肯定。韩春艳等（2004）研究表明，部分驱除原虫可明显提高瘤胃发酵程度，其发酵水平优于全部驱除原虫[9]。卢德勋（2004）综合各种观点，提出通过控制瘤胃原虫种类和数目，可达到充分利用原虫的正面效应得目的，缩小其负面效应的新理论[10]。因此，通过合理调控瘤胃原虫的区系结构及种群密度，创造适宜的瘤胃内环境，是充分发挥原虫有利生理功能，提高反刍动物饲料利用率和生产性能的有效途径。为此，深入了解瘤胃原虫的菌群结构和变化规律，对合理调控瘤胃原虫有重要意义。
大量研究表明，日粮既可以影响原虫的数量，也能影响原虫菌群结构[11]。一般随日粮中精料的增加，瘤胃原虫数量会增多。当日粮中精饲料含量增长到50 %～60%时, 瘤胃内原虫数量最多[2]。但当精料浓度达到60 %以上时，原虫数量会下降甚至消失[12]。其次，日粮精粗比影响原虫中纤毛虫的组成，尤其对内毛虫的数量影响较大。在奶牛上，饲喂干草或牧草时，内毛虫数量占总数的40%90%。当日粮中添加精饲料时，内毛虫数量可达整个纤毛虫数量的90%98% [13]。此外，Ueda等（2003）研究发现，与采食日粮精粗比为35:65的奶牛相比，日粮精粗比为65:35的奶牛，内毛虫的数量显著提高（P<0.05）[14]。并且，随着日粮精粗比的提高，密毛属和均毛属数量也会显著增加，这可能是由于均毛属和密毛属能够优先利用可溶性糖的原因。
因此，通过调整日粮结构来调控反刍动物瘤胃原虫，是一个切实可行的方法。但是目前，有关纤毛虫种属变化的研究较少，且结果不尽相同。其中日粮对瘤胃原虫种属的影响结果因实验条件等不同，差异也很大。因此，有必要就日粮精粗比对原虫种属变化的影响作进一步的研究。本文拟运用荧光定量PCR、高通量测序等手段，监测不同日粮条件下以及不同时间点原虫在山羊瘤胃内的变化规律，同时检测原虫菌群结构的差异。
1.材料与方法
1.1试验动物及试验设计
试验动物为12头8月龄的安装有瘤胃屡管的健康公山羊。饲养于大学动物科技学院动物房，自由饮水。试验开始前，动物经历两个周的适应期，在适应期内自由采食干草和水。适应期后，12头山羊随机分为两组，全草组（Hay, 80%羊草+16%苜蓿，n=6）和高精料组（HG，36.5%小麦+20%玉米+15%豆粕+18%羊草+7%苜蓿，n=6）。两组动物的平均体重为28kg，没有显著性差异。高精料组山羊在试验开始的5天内，精料逐渐增加到75%，以便动物逐渐适应高精料。每头山羊每天采食900 g干物质。每天分别在早晨8:00和下午17:00饲喂。试验期为7个周。
1.2样品采集
在适应期的第二周，通过瘤胃瘘管，随机选取5头羊采集瘤胃内容物。采集时间点分别为饲喂前2 h、饲喂后0 h、2 h、4 h、6 h、8 h，6个时间点连续采集瘤胃内容物，20℃保存，备提DNA，进行定量分析原虫丰度。
12头山羊于试验期第50天早晨饲喂4小时后屠宰，采集瘤胃内容物和瘤胃液，20℃保存，备提DNA和测定挥发性脂肪酸。
1.3 DNA提取
DNA提取采用CTAB/酚氯仿异戊醇法。1 mL瘤胃内容物13000rpm，离心15 min，4℃。破碎细胞释放DNA采用Bead beat，FastPrep instrument (QBiogene)，2×60 s，speed 6.0。
1.4 realtime PCR
原虫定量采用引物如下。前引物：GCTTTCGWTGGTAGTGTATT；后引物：CTTGCCCTCYAATCGTWCT。应用的qPCR仪为Applied Biosystems 7900 RealTime PCR System (Applied Biosystems, California, USA)。qPCR试剂为SYBR? Green PCR Master Mix (ABI)。反应体系10 μL，引物浓度200 nmol/L，DNA模板浓度1~100 ng/μL。反应程序：50℃，2 min；95℃，10 min；接40个循环95℃，15 s；60℃，1 min。标准曲线由引物M13分别扩增两种甲烷菌的PCR产物制作的质粒制成。M13扩增产物经试剂盒纯化后用Qubit? 2.0 Fluorometer和Qubit TM dsDNA BR Assay Kits（Invitrogen）测定DNA浓度。拷贝数有如下公式计算：（amount × 6.022×1023）/（length × 1×109 × 650）。定量时采用103~108 系列浓度标准样品。
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