定点突变不耐热肠毒素ltak63ltar72基因的表达及纯化
：大肠杆菌不耐热肠毒素（heat-labile enterotoxin, LT）是肠产毒性大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）分泌的一种热不稳定肠毒素。LT能引起人和哺乳动物发生水样腹泻，但具有极强的黏膜免疫原性和黏膜佐剂活性，其无毒突变体在黏膜免疫研究中有重要作用。本实验通过PCR重叠延伸法得到LTAK63和LTAR72 2个LT的突变体，测序结果显示突变序列与预期一致。通过NcoⅠ和XholⅠ双酶切将目的基因与pET-16b表达载体连接,并使其在BL21菌株中分别成功表达，表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳和Western-Blot鉴定确认为目的蛋白，通过镍柱纯化成功得到了单一的LTAK63和LTAR72蛋白。本实验为LT突变体的原核表达和纯化提供了资料，希望能为日后LT突变体在黏膜免疫佐剂方面临床应用的研究提供资料。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 引言 1
1.1 大肠杆菌不耐热肠毒素研究概况 1
1.2 LT的分子结构 2
1.3 LT的性质 2
1.4 LT的突变体 2
1.5 LT作为黏膜免疫佐剂的应用前景 2
2 大肠杆菌不耐热肠毒素LTAK63/LTAR72的突变、原核表达和纯化 3
2.1 材料 3
2.1.1 菌株、载体 3
2.1.2 主要试剂 3
2.1.3 培养基和溶液的配制 3
2.1.4 主要仪器 4
2.2 方法 4
2.2.1 LTA基因的突变 4
2.2.2原核表达载体pET16bLTAK63和pET16bLTAR72的构建 6
2.2.3重组质粒pET16bLTAK63和 pET16bLTAR72在原核细胞中的表达 7
2.2.4表达产物Westernblot检测 8
2.2.5表达产物的纯化 8
2.3 结果和分析 8
2.3.1 LTAK63/LTAR72基因突变 8
2.
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
3.2 pET16bLTAK63和 pET16bLTAR72表达载体的酶切鉴定 9
2.3.3 表达产物的SDSPAGE检测 9
2.3.4 表达产物的Western blot检测 10
2.3.5 纯化产物的SDSPAGE检测 10
3 结论 11
致谢 12
参考文献 12
定点突变不耐热肠毒素LTAK63、LTAR72基因的表达和纯化
动物医学院 周烨锋
引言
1 引言
1.1 大肠杆菌不耐热肠毒素研究概况
大肠杆菌不耐热肠毒素（heatlabile enterotoxin, LT）是肠产毒性大肠杆（Enterotoxigenic Escherichia, ETEC）分泌的一种热不稳定肠毒素。LT是AB5型结构的杂合寡聚蛋白,约86 kD。其中A亚基（LTA）约28 kD ,5个相同的约11.5 kD的B亚基（LTB）彼此以共价键结合形成以A亚基为中心的环状五聚体，A亚基和B亚基共同构成六聚体蛋白。能引起人和其他哺乳动物的水样腹泻。LT具有很强的免疫原性和黏膜免疫佐剂活性，但由于其毒性限制了LT的直接用于疫苗研制，因此目前对LT的研究热点主要在于其无毒或低毒突变体[1]。
1.2 LT的分子结构
编码LT的基因全长1148bp，位于野生型产毒性大肠杆菌质粒上，包括LTA 和LTB 2种多肽亚单位。LTA为LT的毒性部位，由A1、A2两个区域构成，两个区域之间通过一个胰蛋白酶敏感回路和一个二硫键连接。A1具有ADP核糖基转移酶活性，A2的羧基端插入LTB寡聚端起到连接B亚单位的作用[2]。LTB空间结构为由5个相同单体构成的中心具有孔径的环形五聚体，相互之间形成30个氢键和6个盐桥构成稳定结构[3]。A、B两个亚基都以前体蛋白的形式被合成，分别带有18和21个信号肽，并在细胞周质中完成LT的组装[4]。
1.3 LT的性质
LT对热不稳定，65℃下30min可完全灭活。LTA由于具有ADP核糖基转移酶活性,可导致细胞内cAMP水平升高,促使细胞电解质和水分流入肠腔,形成腹泻。而B亚基是LT与受体结合部分，无毒性，主要与表达于真核细胞表面的神经节苷脂GM1结合,使LT得以进入细胞内并发挥毒性[5]。
LT与抗原一同免疫后，不但能明显增强机体对抗原的粘膜IgA和IgG反应,同时还能消除机体对这些共免疫抗原的免疫耐受,诱导针对它们的长期记忆[6]。目前LTd 黏膜免疫佐剂机制还未研究清楚，其作为免疫佐剂引起的免疫应答主要有以下几个特点：（1）使机体产生高效价的sIgA和IgG；（2）诱导肠集合淋巴结抗原特异的Th细胞和B细胞应答；（3）诱导MHCII类T细胞介导免疫，使T细胞、IL2、Tc细胞等显著增多，可引起明显的迟发性超敏反应[7]。
1.4 LT的突变体
大量研究发现，LT中毒性亚基LTA的活性位点突变后，在保留了免疫原性的前提下大大降低了LT的毒性，这种无毒或低毒的LT突变体使LT在黏膜免疫中大量应用成为可能[711]。
目前，研究最多的是第63位点的氨基酸。Mariagrazia Pizza等为了研究在NAD结合和催化位点的氨基酸功能，通过点突变的方式将A亚基63位点的丝氨酸突变为赖氨酸，获得突变体LTK63。该突变体稳定性比LT强，对胰蛋白酶的敏感性也比LT低。Fvan Den等在兔回肠实验中。1mgLTK63不能引起腹泻，而50ng的LT便能引起动物腹泻。40ugLTK63对Y1细胞的形态没有影响,但LT只需要3pg就能引起细胞形态的改变，这个结果说明了LTK63突变体毒性比LT小107倍，LTK63突变体的酶活性和毒性大大降低[12]。
有研究者们发现第72位氨基酸对于毒性也是关键位点，因此将72位点的丙氨酸突变为精氨酸得到LTR72。进一步研究发现，LTR72不仅没有改变A亚基的结构，还能正确形成AB5型结构。将LTR72于4℃保存一年后，结构没有发生变化，表明LTR72非常稳定。J A Neidleman等在Y1细胞实验中发现LTE72毒性比LT小100000倍，在兔回肠实验中发现毒性是LT的1%，该突变体的酶活性是LT的0.6%[13]。
除LTK63、LTR72外，还有LTK7、LTE112和双突变体等多种突变体[14]。
1.5 LT作为黏膜免疫佐剂的应用前景
2 大肠杆菌不耐热肠毒素LTAK63/LTAR72的突变、原核表达和纯化
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 引言 1
1.1 大肠杆菌不耐热肠毒素研究概况 1
1.2 LT的分子结构 2
1.3 LT的性质 2
1.4 LT的突变体 2
1.5 LT作为黏膜免疫佐剂的应用前景 2
2 大肠杆菌不耐热肠毒素LTAK63/LTAR72的突变、原核表达和纯化 3
2.1 材料 3
2.1.1 菌株、载体 3
2.1.2 主要试剂 3
2.1.3 培养基和溶液的配制 3
2.1.4 主要仪器 4
2.2 方法 4
2.2.1 LTA基因的突变 4
2.2.2原核表达载体pET16bLTAK63和pET16bLTAR72的构建 6
2.2.3重组质粒pET16bLTAK63和 pET16bLTAR72在原核细胞中的表达 7
2.2.4表达产物Westernblot检测 8
2.2.5表达产物的纯化 8
2.3 结果和分析 8
2.3.1 LTAK63/LTAR72基因突变 8
2.
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
3.2 pET16bLTAK63和 pET16bLTAR72表达载体的酶切鉴定 9
2.3.3 表达产物的SDSPAGE检测 9
2.3.4 表达产物的Western blot检测 10
2.3.5 纯化产物的SDSPAGE检测 10
3 结论 11
致谢 12
参考文献 12
定点突变不耐热肠毒素LTAK63、LTAR72基因的表达和纯化
动物医学院 周烨锋
引言
1 引言
1.1 大肠杆菌不耐热肠毒素研究概况
大肠杆菌不耐热肠毒素（heatlabile enterotoxin, LT）是肠产毒性大肠杆（Enterotoxigenic Escherichia, ETEC）分泌的一种热不稳定肠毒素。LT是AB5型结构的杂合寡聚蛋白,约86 kD。其中A亚基（LTA）约28 kD ,5个相同的约11.5 kD的B亚基（LTB）彼此以共价键结合形成以A亚基为中心的环状五聚体，A亚基和B亚基共同构成六聚体蛋白。能引起人和其他哺乳动物的水样腹泻。LT具有很强的免疫原性和黏膜免疫佐剂活性，但由于其毒性限制了LT的直接用于疫苗研制，因此目前对LT的研究热点主要在于其无毒或低毒突变体[1]。
1.2 LT的分子结构
编码LT的基因全长1148bp，位于野生型产毒性大肠杆菌质粒上，包括LTA 和LTB 2种多肽亚单位。LTA为LT的毒性部位，由A1、A2两个区域构成，两个区域之间通过一个胰蛋白酶敏感回路和一个二硫键连接。A1具有ADP核糖基转移酶活性，A2的羧基端插入LTB寡聚端起到连接B亚单位的作用[2]。LTB空间结构为由5个相同单体构成的中心具有孔径的环形五聚体，相互之间形成30个氢键和6个盐桥构成稳定结构[3]。A、B两个亚基都以前体蛋白的形式被合成，分别带有18和21个信号肽，并在细胞周质中完成LT的组装[4]。
1.3 LT的性质
LT对热不稳定，65℃下30min可完全灭活。LTA由于具有ADP核糖基转移酶活性,可导致细胞内cAMP水平升高,促使细胞电解质和水分流入肠腔,形成腹泻。而B亚基是LT与受体结合部分，无毒性，主要与表达于真核细胞表面的神经节苷脂GM1结合,使LT得以进入细胞内并发挥毒性[5]。
LT与抗原一同免疫后，不但能明显增强机体对抗原的粘膜IgA和IgG反应,同时还能消除机体对这些共免疫抗原的免疫耐受,诱导针对它们的长期记忆[6]。目前LTd 黏膜免疫佐剂机制还未研究清楚，其作为免疫佐剂引起的免疫应答主要有以下几个特点：（1）使机体产生高效价的sIgA和IgG；（2）诱导肠集合淋巴结抗原特异的Th细胞和B细胞应答；（3）诱导MHCII类T细胞介导免疫，使T细胞、IL2、Tc细胞等显著增多，可引起明显的迟发性超敏反应[7]。
1.4 LT的突变体
大量研究发现，LT中毒性亚基LTA的活性位点突变后，在保留了免疫原性的前提下大大降低了LT的毒性，这种无毒或低毒的LT突变体使LT在黏膜免疫中大量应用成为可能[711]。
目前，研究最多的是第63位点的氨基酸。Mariagrazia Pizza等为了研究在NAD结合和催化位点的氨基酸功能，通过点突变的方式将A亚基63位点的丝氨酸突变为赖氨酸，获得突变体LTK63。该突变体稳定性比LT强，对胰蛋白酶的敏感性也比LT低。Fvan Den等在兔回肠实验中。1mgLTK63不能引起腹泻，而50ng的LT便能引起动物腹泻。40ugLTK63对Y1细胞的形态没有影响,但LT只需要3pg就能引起细胞形态的改变，这个结果说明了LTK63突变体毒性比LT小107倍，LTK63突变体的酶活性和毒性大大降低[12]。
有研究者们发现第72位氨基酸对于毒性也是关键位点，因此将72位点的丙氨酸突变为精氨酸得到LTR72。进一步研究发现，LTR72不仅没有改变A亚基的结构，还能正确形成AB5型结构。将LTR72于4℃保存一年后，结构没有发生变化，表明LTR72非常稳定。J A Neidleman等在Y1细胞实验中发现LTE72毒性比LT小100000倍，在兔回肠实验中发现毒性是LT的1%，该突变体的酶活性是LT的0.6%[13]。
除LTK63、LTR72外，还有LTK7、LTE112和双突变体等多种突变体[14]。
1.5 LT作为黏膜免疫佐剂的应用前景
2 大肠杆菌不耐热肠毒素LTAK63/LTAR72的突变、原核表达和纯化
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