D型乳酸利用菌的分离、鉴定及其体外代谢特性的初步研究
D型乳酸利用菌的分离、鉴定及其体外代谢特性的初步研究[20200510205505]
摘要：乳酸广泛存在于人体、动物及微生物代谢之中，也存在于与人类生活密切相关的多种食品中。由于肠道内的各种原因造成乳酸的大量堆积，导致乳酸的中毒，尤其是D型乳酸的积累后果很严重，会引起神经中毒和心律不齐。但乳酸又可以被微生物发酵所利用，生成乙酸，丙酸，丁酸等短链脂肪酸影响肠道的功能以及宿主的健康。本研究主要从猪肠道内分离D型乳酸利用菌，对其进行纯化，筛选和鉴定，得到6株对D型乳酸有高效利用的不同菌株。通过研究其生化特性以及发酵特性，发现这6株菌均能利用D型乳酸，并产生大量的短链脂肪酸，其中Bacteroides vulgatus不仅能利用D型乳酸产生丰富的脂肪酸，例如乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸等，而且丁酸产量显著高于其他菌株。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:D型乳酸；短链脂肪酸；体外发酵
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2 方法 2
1.2.1 D型乳酸利用菌的分离2
1.2.2 D型乳酸利用菌的常规及生化鉴定3
1.2.3 D型乳酸利用菌体外发酵代谢研究3
2 结果与分析4
2.1 D型乳酸利用菌的挑选与分离4
2.2 D型乳酸利用菌的鉴定5
2.3 D型乳酸利用菌的体外发酵性质6
3 讨论7
致谢8
参考文献8
图1 分离到的26株D-乳酸利用菌24h后对D型乳酸的利用率4
图2 菌株DNA的PCR产物经过 1.2%琼脂糖凝胶电泳的电泳图5
图3 以D-乳酸为唯一碳源的YCFA培养基时6株菌的OD值变化图6图4 D型乳酸的浓度变化mmol/L 6
图5 6株菌在D型乳酸YCFA培养基中的短链脂肪酸的产量7
表1 补充不同碳源时菌株的利用情况5
D型乳酸利用菌的分离、鉴定及其体外代谢特性的初步研究
引言
乳酸(α-羟基-丙酸)广泛存在于人体、动物及微生物代谢之中，也存在于与人类生活密切相关的多种食品中。乳酸分子存在两种光学对映体，其理化性能十分相近，只是旋光性相反，一种被称为L-(+)-乳酸或(S)-乳酸，另一种被称为D-(-)-乳酸或(R)-乳酸[1]。在生物体内存在一定含量的乳酸，但是当由于各种原因引起菌群的改变，当乳酸产生菌和乳酸利用菌的平衡被破坏时，造成了乳酸的大量 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
积累，堆积乳酸的肌肉会发生收缩，从而挤压血管,使得血流不畅，结果造成肌肉酸痛、发冷、头痛、头重感等[2,3]。尤其是D-乳酸的积累后果很严重，会引起神经中毒和心律不齐,所以乳酸酸中毒危害很大。但是乳酸可以被肠道微生物所发酵利用，生成短链脂肪酸，主要有乙酸，丙酸,丁酸等，短链脂肪酸能够影响肠道的功能以及宿主的健康，特别是丁酸，具有非常重要的意义[4,5,6,7]。首先,丁酸是结肠粘膜上皮细胞偏好的能源,它可以刺激细胞增殖，促进结肠粘膜释放黏液[8]；其次，丁酸在修复肠黏膜和治疗肠炎时发挥重要作用，同时丁酸具有很强的防止癌变的作用。有报道指出，溃烂性结肠炎患者结肠内丁酸含量显著低于健康个体[9]。所以，丁酸在维持结肠健康和功能方面具有重要作用。基于以上乳酸积累的危害以及挥发性脂肪酸的益处，可以看出，消化道中的乳酸利用菌在维持肠道代谢平衡以及维持内环境稳定方面具有重要作用，其可以改善肠道微生物群系的生态平衡，维持内环境稳态，改善体内乳酸酸中毒尤其是D型乳酸酸中毒，因此，分离动物肠道中的D型乳酸利用菌并研究其代谢特性具有非常重要的意义。
高等哺乳动物体内栖生着许多种类和数量的正常微生物，目前仅在人肠道内就己经鉴定出500多种正常肠道微生物，其数量高达1014，约是人体体细胞和生殖细胞之和的10多倍，大肠由于特殊的位置，结构，酸碱条件和厌氧环境使得其中的微生物种类最复杂，数量最多[10,11,12]。因此，本实验将从猪体内分离D型乳酸利用菌，对其进行纯化，筛选和鉴定，并研究其生化特性以及发酵特性，为乳酸利用菌的合理开发与应用提供科学依据。
1 材料与方法
1．1 D型乳酸利用菌的分离、纯化和筛选
本试验通过利用改进型Hungate技术，采集新鲜猪粪，挑菌纯化，利用了补充乳酸作为唯一碳源的YCFA培养基富集培养，最后分离筛选出D型乳酸利用菌。
1．1．1 实验材料
1.1.1.1 粪样 采用直肠取样法采集成年猪粪样，采用动物自由采食与饮水，体况健康，在取样前一个月内没有注射抗生素和其它任何药物。
1.1.1.2 YCFA培养基(100ml)成分 参考Duncan等（2002）的方法进行培养基配制。YCFA液体培养基(100ml)成分：酪蛋白1g；酵母浸出液0.25g；NaHCO3 0.4g；半胱氨酸0.1g； K2HPO4 0.045g；KH2PO4 0.045g；NaCl 0.09g；MgSO47H20 0.009g；CaCl2 0.009g；血红素1mg；生物素1μg；钻胺素1μg；对氨基苯甲3μg；叶酸5μg；吡哆胺15μg；硫胺素0.05μg；核黄素0.05μg；刃天青0.1mg；添加0.25% w/v D-乳酸作为碳源。YCFA固体培养基成分：在YCFA液体培养基中添加0.75% w/v的琼脂粉。
1.1.1.3 YCFA培养基(100mL)的配置 按照比例称取酪蛋白，酵母浸出液，NaHCO3，半耽氨酸，K2HPO4，KH2PO4，NaCl，MgSO47H20，CaCl2 ,加水溶解，随后加入已经配置好的血红素和热稳定性的维生素，调整pH在5.8-6.1之间，将培养基分装到滚管中，并用橡胶塞密封，进行气体抽换，实现厌氧条件，115℃压强下灭菌20min，待培养基冷却之后，用注射器加入已过滤灭菌的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
热不稳定的硫胺素和核黄素。
1.1.1.4 主要仪器 隔水式恒温培养箱，厌氧工作站，厌氧装配系统，超净工作台，接种环，Hungate滚管，培养皿，GC-14B型气相色谱仪等。
1.1.2 实验方法
1.1.2.1 取样 取新鲜成年猪粪1g,用5mL生理盐水稀释混匀，在通入CO2气流条件下，将混合液通过三层纱布过滤，滤去粪便中固体残渣。
1.1.2.2 富集培养 取1mL滤液接种到装有9mLYCFA培养基的滚管中，并补充0.25% ( W/V)乳酸作为唯一碳源。调整pH为:5.8-6.1。在37℃下富集培养4-5代，每间隔24h 传代一次。这种培养可以富集大量的乳酸利用菌，减少了挑菌的盲目性。
1.1.2.3 挑菌和纯化 取第5代24h发酵液梯度稀释至10- 12，选择 10-8至10-12稀释度作为接种梯度，接种一滴稀释液到融化的滚管固体培养基中，迅速混匀，于冰槽中滚动至培养基凝固，然后置于37℃培养箱中静置培养，待菌落形成之后，转移单个菌落到液体培养基中[13]。按上述方法，进一步纯化单株菌3-4次，以获得较纯的菌株。
1.1.2.4 D型乳酸利用菌的筛选 利用Megazyme D-LACTIC ACID试剂盒检测D型乳酸利用菌利用D型乳酸的能力，挑选利用率高的，保存菌种，并进行后续试验。
1．2 D型乳酸利用菌常规和16S rRNA基因的鉴定与分类
细菌鉴定是指借助于现有的细菌分类系统，通过特征测定，确定未知的、新发现的或未明确分类位置的细菌所应属分类群的过程。现在国际上通常分离提取细菌16S rRNA，用Tl核酸酶消化，分析寡核昔酸的碱基序列可测出 16S rRNA基因的关性，绘制各类群关系和树状谱，从而确定种系的发生关系[14,15,16]。本试验对D型乳酸利用菌的形态、生化和分子生物学性质进行鉴定，从而确定其所属的分类群。
尿素 － － － － － －
水杨素 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
摘要：乳酸广泛存在于人体、动物及微生物代谢之中，也存在于与人类生活密切相关的多种食品中。由于肠道内的各种原因造成乳酸的大量堆积，导致乳酸的中毒，尤其是D型乳酸的积累后果很严重，会引起神经中毒和心律不齐。但乳酸又可以被微生物发酵所利用，生成乙酸，丙酸，丁酸等短链脂肪酸影响肠道的功能以及宿主的健康。本研究主要从猪肠道内分离D型乳酸利用菌，对其进行纯化，筛选和鉴定，得到6株对D型乳酸有高效利用的不同菌株。通过研究其生化特性以及发酵特性，发现这6株菌均能利用D型乳酸，并产生大量的短链脂肪酸，其中Bacteroides vulgatus不仅能利用D型乳酸产生丰富的脂肪酸，例如乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异戊酸等，而且丁酸产量显著高于其他菌株。
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关键字:D型乳酸；短链脂肪酸；体外发酵
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关键词1
Abstract1
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引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2 方法 2
1.2.1 D型乳酸利用菌的分离2
1.2.2 D型乳酸利用菌的常规及生化鉴定3
1.2.3 D型乳酸利用菌体外发酵代谢研究3
2 结果与分析4
2.1 D型乳酸利用菌的挑选与分离4
2.2 D型乳酸利用菌的鉴定5
2.3 D型乳酸利用菌的体外发酵性质6
3 讨论7
致谢8
参考文献8
图1 分离到的26株D-乳酸利用菌24h后对D型乳酸的利用率4
图2 菌株DNA的PCR产物经过 1.2%琼脂糖凝胶电泳的电泳图5
图3 以D-乳酸为唯一碳源的YCFA培养基时6株菌的OD值变化图6图4 D型乳酸的浓度变化mmol/L 6
图5 6株菌在D型乳酸YCFA培养基中的短链脂肪酸的产量7
表1 补充不同碳源时菌株的利用情况5
D型乳酸利用菌的分离、鉴定及其体外代谢特性的初步研究
引言
乳酸(α-羟基-丙酸)广泛存在于人体、动物及微生物代谢之中，也存在于与人类生活密切相关的多种食品中。乳酸分子存在两种光学对映体，其理化性能十分相近，只是旋光性相反，一种被称为L-(+)-乳酸或(S)-乳酸，另一种被称为D-(-)-乳酸或(R)-乳酸[1]。在生物体内存在一定含量的乳酸，但是当由于各种原因引起菌群的改变，当乳酸产生菌和乳酸利用菌的平衡被破坏时，造成了乳酸的大量 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
积累，堆积乳酸的肌肉会发生收缩，从而挤压血管,使得血流不畅，结果造成肌肉酸痛、发冷、头痛、头重感等[2,3]。尤其是D-乳酸的积累后果很严重，会引起神经中毒和心律不齐,所以乳酸酸中毒危害很大。但是乳酸可以被肠道微生物所发酵利用，生成短链脂肪酸，主要有乙酸，丙酸,丁酸等，短链脂肪酸能够影响肠道的功能以及宿主的健康，特别是丁酸，具有非常重要的意义[4,5,6,7]。首先,丁酸是结肠粘膜上皮细胞偏好的能源,它可以刺激细胞增殖，促进结肠粘膜释放黏液[8]；其次，丁酸在修复肠黏膜和治疗肠炎时发挥重要作用，同时丁酸具有很强的防止癌变的作用。有报道指出，溃烂性结肠炎患者结肠内丁酸含量显著低于健康个体[9]。所以，丁酸在维持结肠健康和功能方面具有重要作用。基于以上乳酸积累的危害以及挥发性脂肪酸的益处，可以看出，消化道中的乳酸利用菌在维持肠道代谢平衡以及维持内环境稳定方面具有重要作用，其可以改善肠道微生物群系的生态平衡，维持内环境稳态，改善体内乳酸酸中毒尤其是D型乳酸酸中毒，因此，分离动物肠道中的D型乳酸利用菌并研究其代谢特性具有非常重要的意义。
高等哺乳动物体内栖生着许多种类和数量的正常微生物，目前仅在人肠道内就己经鉴定出500多种正常肠道微生物，其数量高达1014，约是人体体细胞和生殖细胞之和的10多倍，大肠由于特殊的位置，结构，酸碱条件和厌氧环境使得其中的微生物种类最复杂，数量最多[10,11,12]。因此，本实验将从猪体内分离D型乳酸利用菌，对其进行纯化，筛选和鉴定，并研究其生化特性以及发酵特性，为乳酸利用菌的合理开发与应用提供科学依据。
1 材料与方法
1．1 D型乳酸利用菌的分离、纯化和筛选
本试验通过利用改进型Hungate技术，采集新鲜猪粪，挑菌纯化，利用了补充乳酸作为唯一碳源的YCFA培养基富集培养，最后分离筛选出D型乳酸利用菌。
1．1．1 实验材料
1.1.1.1 粪样 采用直肠取样法采集成年猪粪样，采用动物自由采食与饮水，体况健康，在取样前一个月内没有注射抗生素和其它任何药物。
1.1.1.2 YCFA培养基(100ml)成分 参考Duncan等（2002）的方法进行培养基配制。YCFA液体培养基(100ml)成分：酪蛋白1g；酵母浸出液0.25g；NaHCO3 0.4g；半胱氨酸0.1g； K2HPO4 0.045g；KH2PO4 0.045g；NaCl 0.09g；MgSO47H20 0.009g；CaCl2 0.009g；血红素1mg；生物素1μg；钻胺素1μg；对氨基苯甲3μg；叶酸5μg；吡哆胺15μg；硫胺素0.05μg；核黄素0.05μg；刃天青0.1mg；添加0.25% w/v D-乳酸作为碳源。YCFA固体培养基成分：在YCFA液体培养基中添加0.75% w/v的琼脂粉。
1.1.1.3 YCFA培养基(100mL)的配置 按照比例称取酪蛋白，酵母浸出液，NaHCO3，半耽氨酸，K2HPO4，KH2PO4，NaCl，MgSO47H20，CaCl2 ,加水溶解，随后加入已经配置好的血红素和热稳定性的维生素，调整pH在5.8-6.1之间，将培养基分装到滚管中，并用橡胶塞密封，进行气体抽换，实现厌氧条件，115℃压强下灭菌20min，待培养基冷却之后，用注射器加入已过滤灭菌的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
热不稳定的硫胺素和核黄素。
1.1.1.4 主要仪器 隔水式恒温培养箱，厌氧工作站，厌氧装配系统，超净工作台，接种环，Hungate滚管，培养皿，GC-14B型气相色谱仪等。
1.1.2 实验方法
1.1.2.1 取样 取新鲜成年猪粪1g,用5mL生理盐水稀释混匀，在通入CO2气流条件下，将混合液通过三层纱布过滤，滤去粪便中固体残渣。
1.1.2.2 富集培养 取1mL滤液接种到装有9mLYCFA培养基的滚管中，并补充0.25% ( W/V)乳酸作为唯一碳源。调整pH为:5.8-6.1。在37℃下富集培养4-5代，每间隔24h 传代一次。这种培养可以富集大量的乳酸利用菌，减少了挑菌的盲目性。
1.1.2.3 挑菌和纯化 取第5代24h发酵液梯度稀释至10- 12，选择 10-8至10-12稀释度作为接种梯度，接种一滴稀释液到融化的滚管固体培养基中，迅速混匀，于冰槽中滚动至培养基凝固，然后置于37℃培养箱中静置培养，待菌落形成之后，转移单个菌落到液体培养基中[13]。按上述方法，进一步纯化单株菌3-4次，以获得较纯的菌株。
1.1.2.4 D型乳酸利用菌的筛选 利用Megazyme D-LACTIC ACID试剂盒检测D型乳酸利用菌利用D型乳酸的能力，挑选利用率高的，保存菌种，并进行后续试验。
1．2 D型乳酸利用菌常规和16S rRNA基因的鉴定与分类
细菌鉴定是指借助于现有的细菌分类系统，通过特征测定，确定未知的、新发现的或未明确分类位置的细菌所应属分类群的过程。现在国际上通常分离提取细菌16S rRNA，用Tl核酸酶消化，分析寡核昔酸的碱基序列可测出 16S rRNA基因的关性，绘制各类群关系和树状谱，从而确定种系的发生关系[14,15,16]。本试验对D型乳酸利用菌的形态、生化和分子生物学性质进行鉴定，从而确定其所属的分类群。
尿素 － － － － － －
水杨素 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋
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