耐利奈唑胺葡萄球菌的分离鉴定及其耐药性检测
部分葡萄球菌可引起人和动物肺炎、馈烂性关节炎、骨髓炎、心内膜炎及脓毒血症等，甚至引起死亡，是常见的人畜共患病原菌之一。近年来相关研究发现此类细菌对常用抗菌药的耐药率逐年上升，给相关感染的治疗造成困难。利奈唑胺属人工合成的噁唑烷酮类抗菌药，在使用初期对葡萄球菌有良好的抑制作用，近年来此菌对利奈唑胺的敏感性也有降低趋势。本论文拟调查葡萄球菌对利奈唑胺及其它抗菌药物的耐药现状，为临床用药提供参考。本实验从2017-2018年间采自江苏各集约化养殖猪场的猪鼻拭子中分离出565株葡萄球菌，并筛选到33株耐利奈唑胺葡萄球菌，进一步测定了其它20种常见抗菌药对利奈唑胺耐药菌的最小抑菌浓度（MIC），分析其耐药现状。结果显示，分离株对青霉素钠、四环素和夫西地酸表现为完全耐药；对大环内酯类、克林霉素、头孢西丁和利福平也表现出高度耐药性，耐药率在80%-100%之间；对氟喹诺酮类药物恩诺沙星和麻保沙星的耐药率分别为69.70%和54.55%；对万古霉素和庆大霉素的耐药率分别为54.55%和57.78%。除沃尼妙林MIC90为128 mg/L，泰妙菌素、替米考星、阿莫西林、磺胺二甲嘧啶、莫匹罗星的MIC90均≥256 mg/L，洗必泰MIC90为8 mg/L。进一步对耐药菌株的optrA、cfr和cfr-c耐药基因进行检测，结果显示optrA的检出率高达71.15%， cfr的检出率为22.30%，cfr-c未检出。该实验结果提示葡萄球菌对近年来使用的新型抗菌药物产生了一定耐药性，相关新型耐药基因的检测率较高，应引起重视。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words 2
绪论2
材料与方法 3
1.1材料 3
1.1.1 菌株 3
1.1.2 试剂 3
1.1.3 培养基 3
1.1.4 设备 3
1.1.5 耗材 4
1.2 方法4
1.2.1 样品采集4
1.2.2 细菌的分离方法4
1.2.2.1 鼻拭子的分离方法4
1.2.2.2 脏器的分离方法4
1.2.3 葡萄球菌的鉴定方法4
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
1.2.3.1 初步筛选4
1.2.3.2 PCR鉴定4
1.2.4 耐利奈唑胺菌株的筛选5
1.2.4.1 耐药菌株的筛选5
1.2.4.1.1 加药平板和生长法接种物的制备5
1.2.4.1.2 生长法接种物的制备5
1.2.4.2 耐药基因检测6
1.2.5 药敏试验6
2 结果与分析 7
2.1 葡萄球菌鉴定7
2.1.1 菌落特征7
2.1.2 革兰染色7
2.1.3 PCR检测7
2.2耐药性分析8
2.2.1 耐利奈唑胺葡萄球菌筛选结果8
2.2.2 药敏试验结果9
2.2.3 耐药基因检测结果 10
3 讨论 12
3.1试验方法的选择 12
3.2葡萄球菌耐药情况 12
3.3葡萄球菌病的防控措施 13
3.4 新药开发 13
致谢 13
参考文献 13 耐利奈唑胺葡萄球菌的分离鉴定及其耐药性检测
引言
随着养殖业的迅速发展和高度集约化，动物传染病得到了日益广泛的关注。逐渐完善的免疫程序使病毒性传染病基本能够得到控制，而细菌性传染病的控制难度越来越大[1]。葡萄球菌属（Staphylococcus）是一类常见的病原菌，广泛分布在地面、空气、水源、食物中。典型的葡萄球菌为球状，在光镜下呈现为葡萄串状，在液体培养基中排列为双球或短链[2]。在28种葡萄球菌中，部分成员是引起人类和动物溃烂性感染、食物中毒、疳病、肺炎、溃烂性关节炎、骨髓炎、心内膜炎及脓毒血症的主要致病菌[3]。由于该属细菌生长要求低、分布广泛、难以彻底清除、致病性强，其已成为严重危害人类健康并制约养殖业的发展的主要因素之一。
由于用药监管体系尚未健全，尤其是国内各养殖场用药知识的缺乏，大量的抗生素被“乱用”和“滥用”。畜主不仅在治疗或预防动物疾病时不按正确程序用药，而且大量的抗菌药如杆菌肽、喹乙醇等被当做促生长剂混合于饲料中使用。
高浓度的抗生素残留给细菌的选择带来了巨大的压力，使葡萄球菌耐药基因不断产生并更新[4]。葡萄球菌对一些常用的抗生素，如：β内酰胺类，四环素类，大环内酯类和氟喹诺酮类等的敏感性均不同程度地降低。更值得注意的是，葡萄球菌对各类新药也产生了耐药性。杨守深等[5]对从福建省各养猪场分离所得的葡萄球菌进行药敏试验，结果显示：分离株对各类抗生素均有不同水平耐药，其中，对青霉素、红霉素、四环素等表现为完全耐药；对替米考星、恩诺沙星、氟苯尼考、泰妙菌素、庆大霉素、环丙沙星和氯霉素表现出中等水平耐药；利奈唑胺和利福平的敏感性也有所降低。而且，国外相关研究也很充分。Hiral[6]对从印度分离所得39株牛源金黄色葡萄球菌，研究发现多重耐药性较为普遍，大多数菌株对万古霉素出现耐药性。
利奈唑胺属人工合成的恶唑烷酮类抗菌药，是第一个由美国FDA批准用于临床的该类药物，能够有效地抑制革兰阳性球菌生长繁殖，可用于治疗甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（MRSA）和万古霉素耐药肠球菌（VRE）等引起的感染[7]。与其他细菌蛋白质合成抑制剂不同，利奈唑胺只作用于翻译的起始阶段，通过与核糖体50S亚基结合，抑制mRNA与核糖体连接，进而阻止70S起始复合物的形成。因其作用部位和方式的独特性，不易引导与其他药物的交叉耐药性[8]。然而，由于近年来利奈唑胺的不合理使用，利奈唑胺耐受菌株不断被报道。因此，了解耐利奈唑胺葡萄球菌的耐药情况、制定合理用药程序迫在眉睫，对兽医临床研究、养殖业的健康发展以及公共卫生均具有重要意义。本试验通过20种常见抗菌药物对从江苏规模化养殖场分离筛选所得的耐利奈唑胺葡萄球菌的MIC值测定，为兽医临床合理使用抗菌药防治葡萄球菌病提供理论和实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株
本研究使用的菌株由20172018年间采集自江苏盐城各集约化养殖场的鼻拭子和病料分离所得。
1.1.2 试剂
试验药物：青霉素、苯唑西林钠、头孢西丁、磺胺二甲嘧啶、四环素、庆大霉素、氟苯尼考、红霉素、克林霉素、利奈唑胺、万古霉素、恩诺沙星、麻保沙星、莫匹罗星、洗必泰、利福平及夫西地酸等购于杭州微生物试剂有限公司。
PBS缓冲液：精密称取Na2HPO4 1.44 g、NaCl 8.00 g、K2HPO4 0.24 g以及KCl 0.20 g，称量后全部放置于200 mL烧杯中，以超纯水或去离子水溶解，浓盐酸调节PH值约为7.4，使用1 L容量瓶定容。高压灭菌条件为121℃30 min。冷却至室温保存。
TE buffer：1、精密称取Tris121.10 g,溶于800 mL去离子水，充分搅拌，浓盐酸调节PH至8.0，再使用去离子水于1 L容量瓶中定容。高压灭菌条件121℃30 min。冷却至室温后保存。2、精密称取Na2EDTA?2H2O 93.00 g，溶于去离子水400 mL，充分搅拌，调节PH为8.0，最后用去离子水于500 mL容量瓶中定容。高压灭菌条件121℃30 min。冷却至室温后保存。3、量取5 mL 步骤1中配置的TrisHCl，以及1 mL步骤2中配制的EDTA，充分混匀，加入适量去离子水，搅拌，再于500 mL容量瓶中定容。高压灭菌条件121℃30 min。冷却至室温后保存。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words 2
绪论2
材料与方法 3
1.1材料 3
1.1.1 菌株 3
1.1.2 试剂 3
1.1.3 培养基 3
1.1.4 设备 3
1.1.5 耗材 4
1.2 方法4
1.2.1 样品采集4
1.2.2 细菌的分离方法4
1.2.2.1 鼻拭子的分离方法4
1.2.2.2 脏器的分离方法4
1.2.3 葡萄球菌的鉴定方法4
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
1.2.3.1 初步筛选4
1.2.3.2 PCR鉴定4
1.2.4 耐利奈唑胺菌株的筛选5
1.2.4.1 耐药菌株的筛选5
1.2.4.1.1 加药平板和生长法接种物的制备5
1.2.4.1.2 生长法接种物的制备5
1.2.4.2 耐药基因检测6
1.2.5 药敏试验6
2 结果与分析 7
2.1 葡萄球菌鉴定7
2.1.1 菌落特征7
2.1.2 革兰染色7
2.1.3 PCR检测7
2.2耐药性分析8
2.2.1 耐利奈唑胺葡萄球菌筛选结果8
2.2.2 药敏试验结果9
2.2.3 耐药基因检测结果 10
3 讨论 12
3.1试验方法的选择 12
3.2葡萄球菌耐药情况 12
3.3葡萄球菌病的防控措施 13
3.4 新药开发 13
致谢 13
参考文献 13 耐利奈唑胺葡萄球菌的分离鉴定及其耐药性检测
引言
随着养殖业的迅速发展和高度集约化，动物传染病得到了日益广泛的关注。逐渐完善的免疫程序使病毒性传染病基本能够得到控制，而细菌性传染病的控制难度越来越大[1]。葡萄球菌属（Staphylococcus）是一类常见的病原菌，广泛分布在地面、空气、水源、食物中。典型的葡萄球菌为球状，在光镜下呈现为葡萄串状，在液体培养基中排列为双球或短链[2]。在28种葡萄球菌中，部分成员是引起人类和动物溃烂性感染、食物中毒、疳病、肺炎、溃烂性关节炎、骨髓炎、心内膜炎及脓毒血症的主要致病菌[3]。由于该属细菌生长要求低、分布广泛、难以彻底清除、致病性强，其已成为严重危害人类健康并制约养殖业的发展的主要因素之一。
由于用药监管体系尚未健全，尤其是国内各养殖场用药知识的缺乏，大量的抗生素被“乱用”和“滥用”。畜主不仅在治疗或预防动物疾病时不按正确程序用药，而且大量的抗菌药如杆菌肽、喹乙醇等被当做促生长剂混合于饲料中使用。
高浓度的抗生素残留给细菌的选择带来了巨大的压力，使葡萄球菌耐药基因不断产生并更新[4]。葡萄球菌对一些常用的抗生素，如：β内酰胺类，四环素类，大环内酯类和氟喹诺酮类等的敏感性均不同程度地降低。更值得注意的是，葡萄球菌对各类新药也产生了耐药性。杨守深等[5]对从福建省各养猪场分离所得的葡萄球菌进行药敏试验，结果显示：分离株对各类抗生素均有不同水平耐药，其中，对青霉素、红霉素、四环素等表现为完全耐药；对替米考星、恩诺沙星、氟苯尼考、泰妙菌素、庆大霉素、环丙沙星和氯霉素表现出中等水平耐药；利奈唑胺和利福平的敏感性也有所降低。而且，国外相关研究也很充分。Hiral[6]对从印度分离所得39株牛源金黄色葡萄球菌，研究发现多重耐药性较为普遍，大多数菌株对万古霉素出现耐药性。
利奈唑胺属人工合成的恶唑烷酮类抗菌药，是第一个由美国FDA批准用于临床的该类药物，能够有效地抑制革兰阳性球菌生长繁殖，可用于治疗甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（MRSA）和万古霉素耐药肠球菌（VRE）等引起的感染[7]。与其他细菌蛋白质合成抑制剂不同，利奈唑胺只作用于翻译的起始阶段，通过与核糖体50S亚基结合，抑制mRNA与核糖体连接，进而阻止70S起始复合物的形成。因其作用部位和方式的独特性，不易引导与其他药物的交叉耐药性[8]。然而，由于近年来利奈唑胺的不合理使用，利奈唑胺耐受菌株不断被报道。因此，了解耐利奈唑胺葡萄球菌的耐药情况、制定合理用药程序迫在眉睫，对兽医临床研究、养殖业的健康发展以及公共卫生均具有重要意义。本试验通过20种常见抗菌药物对从江苏规模化养殖场分离筛选所得的耐利奈唑胺葡萄球菌的MIC值测定，为兽医临床合理使用抗菌药防治葡萄球菌病提供理论和实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株
本研究使用的菌株由20172018年间采集自江苏盐城各集约化养殖场的鼻拭子和病料分离所得。
1.1.2 试剂
试验药物：青霉素、苯唑西林钠、头孢西丁、磺胺二甲嘧啶、四环素、庆大霉素、氟苯尼考、红霉素、克林霉素、利奈唑胺、万古霉素、恩诺沙星、麻保沙星、莫匹罗星、洗必泰、利福平及夫西地酸等购于杭州微生物试剂有限公司。
PBS缓冲液：精密称取Na2HPO4 1.44 g、NaCl 8.00 g、K2HPO4 0.24 g以及KCl 0.20 g，称量后全部放置于200 mL烧杯中，以超纯水或去离子水溶解，浓盐酸调节PH值约为7.4，使用1 L容量瓶定容。高压灭菌条件为121℃30 min。冷却至室温保存。
TE buffer：1、精密称取Tris121.10 g,溶于800 mL去离子水，充分搅拌，浓盐酸调节PH至8.0，再使用去离子水于1 L容量瓶中定容。高压灭菌条件121℃30 min。冷却至室温后保存。2、精密称取Na2EDTA?2H2O 93.00 g，溶于去离子水400 mL，充分搅拌，调节PH为8.0，最后用去离子水于500 mL容量瓶中定容。高压灭菌条件121℃30 min。冷却至室温后保存。3、量取5 mL 步骤1中配置的TrisHCl，以及1 mL步骤2中配制的EDTA，充分混匀，加入适量去离子水，搅拌，再于500 mL容量瓶中定容。高压灭菌条件121℃30 min。冷却至室温后保存。
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