牛源多种支原体的分离与鉴定
本试验对全国13个疑似发生犊牛呼吸系统疾病的牧场进行无菌采样，将采集的384份鼻拭子样品进行分离、培养、分子生物学鉴定及遗传进化分析，对疑似患病犊牛呼吸系统的进行支原体鉴定。结果显示，有53份阳性分离株在PPLO固体培养基上呈典型“煎蛋样”菌落；固体培养基阳性菌落PCR扩增产物与预期支原体16s rRNA通用引物的目的片段一致，琼脂凝胶电泳显示片段大小为1600bp左右；测序结果与NCBI数据库模式菌株进行对比分析，且相似率均在97%以上，得出样品中有29份牛支原体（54.72%）、11份牛鼻支原体（20.75%）、7份精氨酸支原体（13.21%）、2份产碱支原体（3.77%）、2份马无胆甾原体（3.77%）、2份莱氏甾原体（3.77%）；用Mega7.0构建牛支原体、牛鼻支原体、精氨酸支原体16s rRNA进化树。结果表明，犊牛主要感染牛支原体、牛鼻支原体、精氨酸支原体。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1 材料与方法4
1.1菌株来源4
1.2 试剂与仪器 4
1.2.1 试剂4
1.2.2 仪器4
1.3 培养基的配置4
1.4 支原体的分离、培养与观察5
1.4.1 支原体的分离5
1.4.2 支原体的培养5
1.4.3 支原体的观察5
1.4.4 支原体的纯化5
1.5 支原体的种群鉴定5
1.5.1 引物的设计与合成5
1.5.2 PCR模板处理5
1.5.3 PCR鉴定5
1.5.4 基因序列分析6
2 结果6
2.1 菌落形态观察6
2.1.1 液体培养基结果6
2.1.2 固体培养基结果6
2.2 PCR鉴定结果6
2.3 16S rRNA基因序列分析7
3 讨论 8
致谢10
参考文献10
牛源多种支原体的分离与鉴定
引言
牛呼吸系统疾病阻碍 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
着国内外养牛业的飞速发展，致病菌一般为支原体（Mycoplasma）、呼吸道合胞体病毒（Respiratory syncytial virus, RSV）、多杀性巴氏杆菌（Pasteurellamultocida）等，该病形成的原因较为复杂，由一种病原体感染单一致病，或由多种病原体混合感染引起[1]。根据发病特征，可将牛呼吸系统疾病大致分为白喉型、上呼吸道感染型、肺炎型。患病牛表现为发热、咳嗽、流涕等一系列呼吸系统症状。在生产上，牛在各个年龄段都易患呼吸系统疾病，由此引发的泌乳牛产奶量下降，青年牛肉品质降低，犊牛淘汰率上升等不良表现，都严重影响着世界各地牧场的收益，从而给养牛业造成了巨大经济损失。在欧洲，每年由牛呼吸道疾病造成的经济损失高达1.44~1.92亿欧元，其中与牛源支原体感染有关的约占经济损失的1/4。在美国，每年由牛源支原体感染而造成的经济损失高达3200万美元[2]。
在我国，也不断在患呼吸系统疾病的牛群中分离鉴定出支原体。中国第一例确诊为牛支原体病的是2008年在湖北省等不同地区爆发的以呼吸系统功能紊乱为主要特征的大规模传染病[3~5]；2010年7月，新疆石河子、奎屯等地区规模化奶牛场部分犊牛陆续发生一种以持续高烧、呼吸道症状、胸膜性肺炎和膝关节肿大为特征的牛支原体病[6]。有调查数据表明，奶牛患呼吸系统疾病会导致产奶量大幅下降，对我国的畜牧业造成巨大的经济损失。
有研究指出，支原体感染引起的呼吸系统疾病，对各个年龄段牛均易致病，且犊牛致死率高，最严重时的致病率可达50％。支原体经过粘附、定殖等一系列过程入侵动物机体，通过裂解动物细胞膜以获取其生长繁殖所需的胆固醇等物质，造成细胞膜的损伤与破坏，使得机体功能无法正常运行。支原体主要靶细胞为呼吸道或泌尿生殖道上皮细胞[7]，故临床上支原体感染常伴随着呼吸道及泌尿生殖道症状。此外，支原体生长繁殖过程中释放的神经外毒素度、磷酸酶[8]等物质，会干扰邻近细胞胞内DNA的转录、RNA的翻译以及蛋白质的合成[9]，扰乱正常细胞工作，从而导致或者加重呼吸系统疾病的相关症状。由于支原体不具备细胞壁，抗生素不敏感，临床上难以获得良好的治疗效果，且感染治疗周期较长、易反复；最重要的是经治疗之后的牛群生长速度缓慢，即使痊愈也伴随着较多后遗症。动物一旦感染支原体，通常情况下没有有效的方法将患病牛治愈完全。
本试验采集来自辽宁、山东、江苏、河北、黑龙江、甘肃、内蒙古、北京、山西9个省份，13个牧场的疑似患呼吸系统疾病犊牛鼻拭子样本，利用实验室分离鉴定，结合分子生物学鉴定，遗传进化的分析，以期确定多种牛源支原体。国内对牛源支原体的相关研究较少，本试验对感染呼吸系统的支原体种类进行了鉴定并分析，探索牛呼吸系统疾病中的优势支原体种类，为进一步牛呼吸系统疾病的防控与治疗提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 菌株来源
于辽宁、山东、江苏、河北、黑龙江、甘肃、内蒙古、北京、山西9个省份的13个牧场，按照1：1000的比例采用随机抽样法，采集疑似患呼吸系统疾病的犊牛鼻拭子样品，共计384份。本试验采用刺激喷嚏法[10]以刺激牛的喷嚏反射，使得病牛喷出足够鼻液确保实验室检测程序的正常需求，即将医用长柄棉签轻插入病牛固有鼻腔，在鼻腔内沿同一方向画圈轻轻转动棉签，从而促进呼吸道深部粘液从鼻腔喷出，打开检测用一次性无菌棉式子，完全浸润于喷出的深部粘液。因鼻前庭与外界直接接触，故有大量空气中存在的致病或不致病微生物附着，但其不是真正造成呼吸系统疾病的元凶。研究表明，能够在牛体内定殖且造成呼吸系统症状的支原体可在固有鼻腔内检出。此法通过采集深部粘液，旨在排除鼻前庭内未定殖细菌、支原体等微生物对检测结果造成的影响，保障检测得到的支原体均来自固有鼻腔。另外，为避免空气中杂菌污染，保证无菌操作，将采集好的鼻拭子样本迅速浸入样本贮存液中，密封保存于4℃试剂冷藏箱内，运输至大学猪链球菌OIE参考实验室。
1.2 试剂及仪器
1.2.1 试剂 肉汤粉购自BD公司；酵母粉购自OXOID Co.；马血清购自内蒙华冠农牧业有限公司；琼脂粉购自BIOSHARP Co.；2*Rapid Taq Master Mix购自Vazyme Biotech Co.；2000bp Marker购自TransGen Biotech Co.。
1.2.2 仪器 超净台、CO2恒温培养箱、HITACHI低温高速离心机、Motic倒置显微镜、SensoQuest热循环仪、凝胶电泳仪等均由大学猪链球菌OIE参考实验室提供。
1.3 培养基的配置
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1 材料与方法4
1.1菌株来源4
1.2 试剂与仪器 4
1.2.1 试剂4
1.2.2 仪器4
1.3 培养基的配置4
1.4 支原体的分离、培养与观察5
1.4.1 支原体的分离5
1.4.2 支原体的培养5
1.4.3 支原体的观察5
1.4.4 支原体的纯化5
1.5 支原体的种群鉴定5
1.5.1 引物的设计与合成5
1.5.2 PCR模板处理5
1.5.3 PCR鉴定5
1.5.4 基因序列分析6
2 结果6
2.1 菌落形态观察6
2.1.1 液体培养基结果6
2.1.2 固体培养基结果6
2.2 PCR鉴定结果6
2.3 16S rRNA基因序列分析7
3 讨论 8
致谢10
参考文献10
牛源多种支原体的分离与鉴定
引言
牛呼吸系统疾病阻碍 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
着国内外养牛业的飞速发展，致病菌一般为支原体（Mycoplasma）、呼吸道合胞体病毒（Respiratory syncytial virus, RSV）、多杀性巴氏杆菌（Pasteurellamultocida）等，该病形成的原因较为复杂，由一种病原体感染单一致病，或由多种病原体混合感染引起[1]。根据发病特征，可将牛呼吸系统疾病大致分为白喉型、上呼吸道感染型、肺炎型。患病牛表现为发热、咳嗽、流涕等一系列呼吸系统症状。在生产上，牛在各个年龄段都易患呼吸系统疾病，由此引发的泌乳牛产奶量下降，青年牛肉品质降低，犊牛淘汰率上升等不良表现，都严重影响着世界各地牧场的收益，从而给养牛业造成了巨大经济损失。在欧洲，每年由牛呼吸道疾病造成的经济损失高达1.44~1.92亿欧元，其中与牛源支原体感染有关的约占经济损失的1/4。在美国，每年由牛源支原体感染而造成的经济损失高达3200万美元[2]。
在我国，也不断在患呼吸系统疾病的牛群中分离鉴定出支原体。中国第一例确诊为牛支原体病的是2008年在湖北省等不同地区爆发的以呼吸系统功能紊乱为主要特征的大规模传染病[3~5]；2010年7月，新疆石河子、奎屯等地区规模化奶牛场部分犊牛陆续发生一种以持续高烧、呼吸道症状、胸膜性肺炎和膝关节肿大为特征的牛支原体病[6]。有调查数据表明，奶牛患呼吸系统疾病会导致产奶量大幅下降，对我国的畜牧业造成巨大的经济损失。
有研究指出，支原体感染引起的呼吸系统疾病，对各个年龄段牛均易致病，且犊牛致死率高，最严重时的致病率可达50％。支原体经过粘附、定殖等一系列过程入侵动物机体，通过裂解动物细胞膜以获取其生长繁殖所需的胆固醇等物质，造成细胞膜的损伤与破坏，使得机体功能无法正常运行。支原体主要靶细胞为呼吸道或泌尿生殖道上皮细胞[7]，故临床上支原体感染常伴随着呼吸道及泌尿生殖道症状。此外，支原体生长繁殖过程中释放的神经外毒素度、磷酸酶[8]等物质，会干扰邻近细胞胞内DNA的转录、RNA的翻译以及蛋白质的合成[9]，扰乱正常细胞工作，从而导致或者加重呼吸系统疾病的相关症状。由于支原体不具备细胞壁，抗生素不敏感，临床上难以获得良好的治疗效果，且感染治疗周期较长、易反复；最重要的是经治疗之后的牛群生长速度缓慢，即使痊愈也伴随着较多后遗症。动物一旦感染支原体，通常情况下没有有效的方法将患病牛治愈完全。
本试验采集来自辽宁、山东、江苏、河北、黑龙江、甘肃、内蒙古、北京、山西9个省份，13个牧场的疑似患呼吸系统疾病犊牛鼻拭子样本，利用实验室分离鉴定，结合分子生物学鉴定，遗传进化的分析，以期确定多种牛源支原体。国内对牛源支原体的相关研究较少，本试验对感染呼吸系统的支原体种类进行了鉴定并分析，探索牛呼吸系统疾病中的优势支原体种类，为进一步牛呼吸系统疾病的防控与治疗提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 菌株来源
于辽宁、山东、江苏、河北、黑龙江、甘肃、内蒙古、北京、山西9个省份的13个牧场，按照1：1000的比例采用随机抽样法，采集疑似患呼吸系统疾病的犊牛鼻拭子样品，共计384份。本试验采用刺激喷嚏法[10]以刺激牛的喷嚏反射，使得病牛喷出足够鼻液确保实验室检测程序的正常需求，即将医用长柄棉签轻插入病牛固有鼻腔，在鼻腔内沿同一方向画圈轻轻转动棉签，从而促进呼吸道深部粘液从鼻腔喷出，打开检测用一次性无菌棉式子，完全浸润于喷出的深部粘液。因鼻前庭与外界直接接触，故有大量空气中存在的致病或不致病微生物附着，但其不是真正造成呼吸系统疾病的元凶。研究表明，能够在牛体内定殖且造成呼吸系统症状的支原体可在固有鼻腔内检出。此法通过采集深部粘液，旨在排除鼻前庭内未定殖细菌、支原体等微生物对检测结果造成的影响，保障检测得到的支原体均来自固有鼻腔。另外，为避免空气中杂菌污染，保证无菌操作，将采集好的鼻拭子样本迅速浸入样本贮存液中，密封保存于4℃试剂冷藏箱内，运输至大学猪链球菌OIE参考实验室。
1.2 试剂及仪器
1.2.1 试剂 肉汤粉购自BD公司；酵母粉购自OXOID Co.；马血清购自内蒙华冠农牧业有限公司；琼脂粉购自BIOSHARP Co.；2*Rapid Taq Master Mix购自Vazyme Biotech Co.；2000bp Marker购自TransGen Biotech Co.。
1.2.2 仪器 超净台、CO2恒温培养箱、HITACHI低温高速离心机、Motic倒置显微镜、SensoQuest热循环仪、凝胶电泳仪等均由大学猪链球菌OIE参考实验室提供。
1.3 培养基的配置
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