载锌凹凸棒石黏土中锌的解吸规律及其对大肠杆菌K88的作用研究
载锌凹凸棒石黏土中锌的解吸规律及其对大肠杆菌K88的作用研究[20200507190859]
摘要：本试验通过体外模拟仔猪胃肠道环境，研究载锌凹凸棒石黏土（载锌凹土）中锌的解吸规律和其对大肠杆菌的抑制、吸附效果。结果表明：锌的解吸率与添加量呈负相关，与Na+、NH4+离子浓度成正相关,但随时间的变化规律不明显。固相载锌凹土的最低抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）分别为12.5和15.625mg/mL；液相载锌凹土的MIC和MBC分别为100和125mg/mL。固相、液相载锌凹土和凹土原土对大肠杆菌吸附率分别在60、20和10min时达到最高，在添加量分别为10、2.5和10mg/mL时对细菌吸附率最高。结果提示，载锌凹土在体外模拟仔猪胃肠道环境下可释放锌离子，并能对大肠杆菌起到抑制和吸附作用。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
关键字:载锌凹凸棒石黏土；大肠杆菌；锌解吸；细菌吸附
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 试验原材料与主要试验设备2
1.2 载锌凹土的制备 2
1.2.1 固相离子交换法制备载锌凹土2
1.2.2 液相离子交换法制备载锌凹土2
1.3 细菌悬浮液的制备3
1.4 试验设计3
1.4.1 载锌凹土中锌离子解吸规律3
1.4.2 载锌凹土对大肠杆菌K88的抑制、吸附作用3
2 结果与分析3
2.1 载锌凹土中锌离子解吸规律3
2.1.1 不同载锌凹土添加量条件下锌解吸规律4
2.1.2 不同解吸时间条件下锌解吸规律4
2.1.3 不同离子浓度条件下锌解吸规律5
2.2 载锌凹土对大肠杆菌K88抑制、吸附作用6
2．2．1 最低抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）7
2．2．2 蛋白质量浓度与菌量的关系7
2．2．3 不同时间条件下载锌凹土对大肠杆菌K88吸附率7
2．2．4 不同浓度载锌凹土对大肠杆菌K88吸附率 8
3 讨论 8
3.1 载锌凹土中锌离子解吸规律8 3.2 载锌凹土对大肠杆菌K88抑制、吸附作用9
4 结论 9
致谢10
参考文献10
载锌凹凸棒石黏土中锌的解吸规律及其对大肠杆菌K88的作用研究
引言
目前规模化养猪业多釆用仔猪早期断奶技术，而仔猪断奶时消化器官发育不完善，肠道中病原菌过量增殖会引起机 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
体氧化应激和免疫反应，造成动物肠道功能受损、死淘增加、生产性能下降，甚至污染动物性食品，给动物和食品安全带来隐患。为此，低剂量抗生素长期被用于动物日粮中以控制肠道潜在的致病菌，但抗生素的长期低剂量使用在抑制和杀灭有害菌的同时，也会对有益优势菌群产生抑制、杀灭等作用，造成耐药病原菌产生、抗生素效力下降、内源性感染及畜产品中药物残留等危害，饲料中限用或禁用抗生素已成为必然趋势[1-2]，寻找抗生素类替代品已成为目前的研究热点之一。
无机抗菌剂作为一种抗生素替代品得到日益关注，它是一类以沸石、凹凸棒石黏土（凹土）和膨润土等多孔物质为载体，负载Ag+、Cu2+、Zn2+等具有抑菌或杀菌能力的金属离子、氧化物或光催化材料等制备的抗菌剂[3]。金属离子是抗菌剂中关键的抗菌成分，它们的抗菌能力强弱顺序为：Ag>Co>Ni≥Al≥Zn≥Cu=Fe>Mn≥Sn>Ba≥Mg≥Ca[4]。无机抗菌剂材料具有无耐药性、无药物残留、耐热性好等优点，特别是金属离子型无机抗菌剂具有缓释性能好、吸附和杀灭细菌、吸附毒素等多种效果[5]。
凹土是一种具有链层状结构的含水富镁铝硅酸盐矿物，单元层间通过氧连接成孔道式的晶体结构，单晶排列成晶束后相互聚集成微米颗粒[6]，这种特殊结构导致凹土具有很强的吸附性和离子交换性[7]。动物摄入添加凹土的饲料后，在胃、肠蛋白酶的作用下，饲料中大分子蛋白质、多肽被分解成带负电荷的氨基酸，与从凹土中游离出来的带正电的阳离子（如Na+、K+、Ca2+、Mg2+等）在胃肠液中发生作用而呈中性，易于被肠道黏膜吸收[8]。凹土进入动物胃肠道后还可促进小肠绒毛的生长[9]，抑制动物胃肠道内的病毒、细菌，吸附其所产生的毒素[10]及氨等有害物质，改善肠道微生态环境，增强动物抗病能力。
锌与动物的生长、繁殖、食欲、免疫、激素激活均密切相关，仔猪饲粮中需要额外添加锌。畜牧生产中的锌添加剂经历了无机锌和有机锌阶段：无机锌包括硫酸锌、氧化锌、碳酸锌、氯化锌等；有机锌有络合锌、蛋白质锌和有机螯合锌等。在日粮中添加锌制剂可以提高生长速度和改善饲料转化率，降低仔猪腹泻率和死亡率[11]。
载锌凹土是利用无机锌和凹土通过离子交换法制得的一种无机抗菌剂。目前制备载锌凹土的方法有液相和固相离子交换法。液相法是利用凹土与ZnCl2溶液在一定温度下搅拌反应一定时间制备的。但该法存在工艺复杂、锌负载量低等缺陷。固相法是将凹土和ZnCl2固体按一定比例混合，在马弗炉中高温反应一段时间制备的。该法具有工艺简单、锌负载量大等优点，更适合实际生产应用。研究表明，用液相法制备的载锌凹土具有很好的抑菌能力，可改善肉鸡生产性能，调节机体免疫功能[12]，负载在凹土上的锌可被缓慢释放，提高锌离子的利用率[13]，但目前鲜有关于液相与固相载锌凹土在仔猪胃肠道中锌的解吸及对肠道有害菌群作用的研究。本试验用液相、固相法分别制备载锌凹土，通过体外模拟仔猪胃肠道环境，研究其锌的解吸规律及对大肠杆菌K88的抑制、吸附作用，以期为载锌凹土的合理应用提供理论依据。
1 材料与方法
1．1 试验原材料与主要试验设备
原料：试验用凹土由江苏神力特生物科技有限公司提供，粒径大小<75μm；大肠杆菌K88菌种，购于国家兽医微生物菌种保藏中心。
试剂：ZnCl2、HCl、NaOH、AgNO3、NaH2PO4、Na *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
2HPO4、NaCl、CaCl2、NH4Cl、超纯水、浓硝酸、鱼粉蛋白胨、酵母提取物、琼脂、BCA试剂盒。
试验设备：电子天平、恒温水浴锅、低温大容量离心机、涡旋混匀仪、数显电热鼓风干燥箱、pH计、多通道电感耦合等离子体质谱仪（ICP）、高压蒸汽灭菌锅、磁力搅拌器。
1．2 载锌凹土的制备
1．2．1 固相离子交换法制备载锌凹土 凹土在反应前于300℃马弗炉中活化3 h，在干燥器冷却后，按照ZnCl2:凹土=0.2:1比例混合均匀，在400℃于马弗炉中煅烧2.5h后，取出置于干燥器中冷却后备用。
1．2．2 液相离子交换法制备载锌凹土 凹土在反应前于300℃马弗炉中活化3 h，冷却后凹土与ZnCl2溶液（1.0mol/L，pH=4.0）按固液比1:10混合，在磁力搅拌器上60℃搅拌3h。反应后样品用双蒸水洗去未负载的Zn2+离子。将洗净的载锌凹土于105℃烘干后粉碎备用。
分别称取0.4 g上述两种方法制备的载锌凹土置于锥形瓶中，取40mL 0.1%HNO3浸泡样品，于65℃恒温水浴锅中浸泡24h后取上清液稀释一定倍数，采用多通道电感耦合等离子体质谱仪（ICP）测定Zn2+离子浓度。
1．3 细菌悬浮液的制备
参照Hu等[14]的方法制备大肠杆菌K88悬浮液。取-20℃保存的大肠杆菌K88解冻后接种到溶菌肉汤（LB）培养基中，在37℃下160r/min振荡培养12h后，再次接种到新鲜LB培养基中，培养3h进入对数期。在4℃下4500r/min离心10min，弃去上层培养基，用0.86%生理盐水洗涤3次，最后将大肠杆菌K88重新悬浮于0.86%生理盐水中，备用。制备的细菌悬浮液用涂布平板法测得活菌数为10×108CFU/mL。
15.625 -/- 125 -/-
12.5 -/+ 100 -/+
优秀（15—11分） 一般（10—6分） 较差（5—0分）
五、论文写作的规范化程度
摘要：本试验通过体外模拟仔猪胃肠道环境，研究载锌凹凸棒石黏土（载锌凹土）中锌的解吸规律和其对大肠杆菌的抑制、吸附效果。结果表明：锌的解吸率与添加量呈负相关，与Na+、NH4+离子浓度成正相关,但随时间的变化规律不明显。固相载锌凹土的最低抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）分别为12.5和15.625mg/mL；液相载锌凹土的MIC和MBC分别为100和125mg/mL。固相、液相载锌凹土和凹土原土对大肠杆菌吸附率分别在60、20和10min时达到最高，在添加量分别为10、2.5和10mg/mL时对细菌吸附率最高。结果提示，载锌凹土在体外模拟仔猪胃肠道环境下可释放锌离子，并能对大肠杆菌起到抑制和吸附作用。
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关键字:载锌凹凸棒石黏土；大肠杆菌；锌解吸；细菌吸附
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 试验原材料与主要试验设备2
1.2 载锌凹土的制备 2
1.2.1 固相离子交换法制备载锌凹土2
1.2.2 液相离子交换法制备载锌凹土2
1.3 细菌悬浮液的制备3
1.4 试验设计3
1.4.1 载锌凹土中锌离子解吸规律3
1.4.2 载锌凹土对大肠杆菌K88的抑制、吸附作用3
2 结果与分析3
2.1 载锌凹土中锌离子解吸规律3
2.1.1 不同载锌凹土添加量条件下锌解吸规律4
2.1.2 不同解吸时间条件下锌解吸规律4
2.1.3 不同离子浓度条件下锌解吸规律5
2.2 载锌凹土对大肠杆菌K88抑制、吸附作用6
2．2．1 最低抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）7
2．2．2 蛋白质量浓度与菌量的关系7
2．2．3 不同时间条件下载锌凹土对大肠杆菌K88吸附率7
2．2．4 不同浓度载锌凹土对大肠杆菌K88吸附率 8
3 讨论 8
3.1 载锌凹土中锌离子解吸规律8 3.2 载锌凹土对大肠杆菌K88抑制、吸附作用9
4 结论 9
致谢10
参考文献10
载锌凹凸棒石黏土中锌的解吸规律及其对大肠杆菌K88的作用研究
引言
目前规模化养猪业多釆用仔猪早期断奶技术，而仔猪断奶时消化器官发育不完善，肠道中病原菌过量增殖会引起机 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
体氧化应激和免疫反应，造成动物肠道功能受损、死淘增加、生产性能下降，甚至污染动物性食品，给动物和食品安全带来隐患。为此，低剂量抗生素长期被用于动物日粮中以控制肠道潜在的致病菌，但抗生素的长期低剂量使用在抑制和杀灭有害菌的同时，也会对有益优势菌群产生抑制、杀灭等作用，造成耐药病原菌产生、抗生素效力下降、内源性感染及畜产品中药物残留等危害，饲料中限用或禁用抗生素已成为必然趋势[1-2]，寻找抗生素类替代品已成为目前的研究热点之一。
无机抗菌剂作为一种抗生素替代品得到日益关注，它是一类以沸石、凹凸棒石黏土（凹土）和膨润土等多孔物质为载体，负载Ag+、Cu2+、Zn2+等具有抑菌或杀菌能力的金属离子、氧化物或光催化材料等制备的抗菌剂[3]。金属离子是抗菌剂中关键的抗菌成分，它们的抗菌能力强弱顺序为：Ag>Co>Ni≥Al≥Zn≥Cu=Fe>Mn≥Sn>Ba≥Mg≥Ca[4]。无机抗菌剂材料具有无耐药性、无药物残留、耐热性好等优点，特别是金属离子型无机抗菌剂具有缓释性能好、吸附和杀灭细菌、吸附毒素等多种效果[5]。
凹土是一种具有链层状结构的含水富镁铝硅酸盐矿物，单元层间通过氧连接成孔道式的晶体结构，单晶排列成晶束后相互聚集成微米颗粒[6]，这种特殊结构导致凹土具有很强的吸附性和离子交换性[7]。动物摄入添加凹土的饲料后，在胃、肠蛋白酶的作用下，饲料中大分子蛋白质、多肽被分解成带负电荷的氨基酸，与从凹土中游离出来的带正电的阳离子（如Na+、K+、Ca2+、Mg2+等）在胃肠液中发生作用而呈中性，易于被肠道黏膜吸收[8]。凹土进入动物胃肠道后还可促进小肠绒毛的生长[9]，抑制动物胃肠道内的病毒、细菌，吸附其所产生的毒素[10]及氨等有害物质，改善肠道微生态环境，增强动物抗病能力。
锌与动物的生长、繁殖、食欲、免疫、激素激活均密切相关，仔猪饲粮中需要额外添加锌。畜牧生产中的锌添加剂经历了无机锌和有机锌阶段：无机锌包括硫酸锌、氧化锌、碳酸锌、氯化锌等；有机锌有络合锌、蛋白质锌和有机螯合锌等。在日粮中添加锌制剂可以提高生长速度和改善饲料转化率，降低仔猪腹泻率和死亡率[11]。
载锌凹土是利用无机锌和凹土通过离子交换法制得的一种无机抗菌剂。目前制备载锌凹土的方法有液相和固相离子交换法。液相法是利用凹土与ZnCl2溶液在一定温度下搅拌反应一定时间制备的。但该法存在工艺复杂、锌负载量低等缺陷。固相法是将凹土和ZnCl2固体按一定比例混合，在马弗炉中高温反应一段时间制备的。该法具有工艺简单、锌负载量大等优点，更适合实际生产应用。研究表明，用液相法制备的载锌凹土具有很好的抑菌能力，可改善肉鸡生产性能，调节机体免疫功能[12]，负载在凹土上的锌可被缓慢释放，提高锌离子的利用率[13]，但目前鲜有关于液相与固相载锌凹土在仔猪胃肠道中锌的解吸及对肠道有害菌群作用的研究。本试验用液相、固相法分别制备载锌凹土，通过体外模拟仔猪胃肠道环境，研究其锌的解吸规律及对大肠杆菌K88的抑制、吸附作用，以期为载锌凹土的合理应用提供理论依据。
1 材料与方法
1．1 试验原材料与主要试验设备
原料：试验用凹土由江苏神力特生物科技有限公司提供，粒径大小<75μm；大肠杆菌K88菌种，购于国家兽医微生物菌种保藏中心。
试剂：ZnCl2、HCl、NaOH、AgNO3、NaH2PO4、Na *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
2HPO4、NaCl、CaCl2、NH4Cl、超纯水、浓硝酸、鱼粉蛋白胨、酵母提取物、琼脂、BCA试剂盒。
试验设备：电子天平、恒温水浴锅、低温大容量离心机、涡旋混匀仪、数显电热鼓风干燥箱、pH计、多通道电感耦合等离子体质谱仪（ICP）、高压蒸汽灭菌锅、磁力搅拌器。
1．2 载锌凹土的制备
1．2．1 固相离子交换法制备载锌凹土 凹土在反应前于300℃马弗炉中活化3 h，在干燥器冷却后，按照ZnCl2:凹土=0.2:1比例混合均匀，在400℃于马弗炉中煅烧2.5h后，取出置于干燥器中冷却后备用。
1．2．2 液相离子交换法制备载锌凹土 凹土在反应前于300℃马弗炉中活化3 h，冷却后凹土与ZnCl2溶液（1.0mol/L，pH=4.0）按固液比1:10混合，在磁力搅拌器上60℃搅拌3h。反应后样品用双蒸水洗去未负载的Zn2+离子。将洗净的载锌凹土于105℃烘干后粉碎备用。
分别称取0.4 g上述两种方法制备的载锌凹土置于锥形瓶中，取40mL 0.1%HNO3浸泡样品，于65℃恒温水浴锅中浸泡24h后取上清液稀释一定倍数，采用多通道电感耦合等离子体质谱仪（ICP）测定Zn2+离子浓度。
1．3 细菌悬浮液的制备
参照Hu等[14]的方法制备大肠杆菌K88悬浮液。取-20℃保存的大肠杆菌K88解冻后接种到溶菌肉汤（LB）培养基中，在37℃下160r/min振荡培养12h后，再次接种到新鲜LB培养基中，培养3h进入对数期。在4℃下4500r/min离心10min，弃去上层培养基，用0.86%生理盐水洗涤3次，最后将大肠杆菌K88重新悬浮于0.86%生理盐水中，备用。制备的细菌悬浮液用涂布平板法测得活菌数为10×108CFU/mL。
15.625 -/- 125 -/-
12.5 -/+ 100 -/+
优秀（15—11分） 一般（10—6分） 较差（5—0分）
五、论文写作的规范化程度
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