新型鸭呼肠孤病毒的分离与鉴定(附件)
[目的]对从临床表现为肝、脾坏死的病死鸭体内分离到的5株疑似鸭呼肠孤病毒进行分离与鉴定。[方法]通过形态学、生物学特性和部分理化特性测定以及PCR检测、σC基因序列分析，确证其为新型鸭呼肠孤病毒（NDRV），并分别命名为RPVA1311、RPVA1312、RPVA1313、RPVA1314和RPVA1315。[结果]电镜下可见NDRV分离毒株的病毒粒子呈球形、直径70 nm左右、无囊膜、双层衣壳；NDRV分离毒株σC基因序列与禽呼肠孤病毒（ARV）和番鸭呼肠孤病毒（MDRV）的核苷酸同源性分别为38% ~ 41%和40% ~ 50%，具有不同于ARV和MDRV的特征；NDRV分离毒株σC基因序列与禽呼肠孤病毒（ARV）和番鸭呼肠孤病毒（MDRV）的核苷酸同源性分别为38% ~ 41%和40% ~ 50%，有不同于ARV和MDRV的特点；NDRV分离毒株能在鸡肝癌细胞（LMH）、鸡胚成纤维细胞（CEF）和鸡胚肝细胞（CEL）中增殖并产生细胞融合、形成合胞体的细胞病变，病毒滴度在105.5~107.0 TCID50/0.1mL（LMH）之间；NDRV分离毒株经绒毛尿囊膜接种，能100%致死11日龄樱桃谷肉鸭胚，且鸭胚组织毒滴度不低于105.0 ELD50/0.2mL，主要病变为全身性出血；4日龄雏樱桃谷肉鸭经腿部肌肉接种NDRV分离毒株后，出现与自然发病鸭相似的病症，发病率为100%，同时能从病死鸭的肝、脾中再次分离到原病毒；病死鸭主要病变为脾脏肿大、坏死，组织病理学观察可见脾脏淋巴细胞数量减少、组织细胞坏死，肝细胞变性、炎性细胞在汇管区周围浸润；部分理化性质测定结果显示，NDRV分离毒株对氯仿不敏感，对胰酶具有不同程度的敏感性。[结论]结果表明，分离的5株病毒是属于呼肠孤病毒科、正呼肠孤病毒属的一种新型鸭呼肠孤病毒。
目录
缩略词表...........I
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words2
引言2
1 材料与方法2
1.1 试验材料 2
1.1.1 样品采集2
1.1.2 试验用细胞、鸭胚和实验动物2
1.1.3 主要仪器设备和耗材2
1.1.4 主要试剂...... *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
.....3
1.2 试验方法 3
1.2.1 病毒分离..3
1.2.2 分子生物学鉴定3
1.2.3 序列分析3
1.2.4 电镜观察3
1.2.5 部分生物学特性鉴定3
1.2.6 部分理化特性鉴定4
2 结果与分析5
2.1 病毒分离5
2.2 病毒鉴定5
2.2.1 分子生物学鉴定5
2.2.2 序列分析.5
2.2.3 电镜观察..7
2.2.4 部分生物学特性鉴定7
2.2.5 部分理化特性鉴定13
3 讨论14
致谢16
参考文献16 缩略词表
英文缩写
英文全称
中文对照
ARV
Avian Reovirus
禽呼肠孤病毒
CEF
Chicken Embryo Fibroblast
鸡胚成纤维细胞
CEL
Chicken Embryo Liver cell
鸡胚肝细胞
d
date
天
DRV
Duck Reovirus
鸭呼肠孤病毒
ELD50
Embryo Lethal Dose 50
胚半数致死量
g
gram
克
h
hour
小时
LMH
Leghorn Malechicken Hepatocellular carcinoma
鸡肝癌细胞系
MDRV
Muscovy Duck Reovirus
番鸭呼肠孤病毒
mg
milligram
毫克
mL
milliliter
毫升
min
minute
分
NDRV
Novel Duck Reovirus
新型鸭呼肠孤病毒
PCR
Polymerase Chain Reaction
聚合酶链反应
rpm
rotation per min
转每分钟
s
second
秒
TCID50
Tissue Culture Infective Dose 50
组织细胞培养半数感染量
μg
microgram
微克
μl
microliter
微升
新型鸭呼肠孤病毒的分离与鉴定
引言
自1997年以来，在中国福建、浙江、广东等番鸭养殖省暴发了一种以软脚为主要临床症状，以肝、脾表面有多量白点为主要病理变化的“番鸭肝白点病”[1]。2001年，福建农林大学首次分离并鉴定了该病病原为呼肠孤病毒科、正呼肠孤病毒属、番鸭呼肠孤病毒[2]。近年来，半番鸭、北京鸭和野鸭等多品种鸭都陆续出现了感染和发病，其临床表现差异很大，主要表现为免疫抑制和生长障碍等，通过分离和鉴定均证实为新型鸭呼肠孤病毒（Novel Duck Reovirus，NDRV）[36]。新型鸭呼肠孤病毒感染已成为近几年在全国各地鸭养殖区流行发生的一种危害严重的传染病。
我们于2017年9月至12月，自广西、山东、广东及江苏等地的养鸭场采集到一批以樱桃谷肉鸭、番鸭为感染对象，年龄主要集中于5 ~ 20日龄，具有典型的肝脾坏死特征的疑似DRV感染的病变肝脏、脾脏等样品。通过形态学观察、生物学特性和理化特性测定以及σC基因序列分析等方面，了解新型鸭呼肠孤病毒的病原特点及致病特征，为禽呼肠孤病毒的流行病学调查和分类提供素材，继而为有效防控鸭呼肠孤病毒病提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 样品采集 2017年9月 ~ 12月自广西、山东、广东及江苏等省的养鸭场采集的5份疑似DRV感染病鸭的病变肝脏、脾脏等样品；鸭呼肠孤阳性对照株由天津渤海农牧产业联合研究院有限公司惠赠。
1.1.2 试验用细胞、鸭胚和实验动物 LMH细胞购自ATCC细胞库；1日龄肉鸭胚、1日龄肉鸭均购自河北安新无呼肠孤病毒感染的某鸭场；1日龄SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。
1.1.3 主要仪器设备和耗材 电脑孵化设备（600IB型）为北京海江孵化设备制造有限公司产品；生物安全柜（NU4256000S型）为美国Nuaire公司产品；生化培养箱（SPX250型）为宁波市科技园区新江南仪器有限公司产品；超低温冰箱（EXF24086V型）为Thermo Scientific Revco公司产品；XSP37XB三目倒置生物显微镜（DSZLV320型）为上海川翔生物科技有限公司产品；正置显微镜（CIL型）为上海Nikon仪器有限公司产品；CO2 恒温培养箱（INC153型）为德国memmert有限公司产品；梯度PCR扩增仪（T100型）为美国BioRad 公司产品；凝胶成像分析系统（GELDOCXR+型）为美国BioRad公司产品；电泳仪、水平电泳槽（DYY6D型）为北京市六一仪器厂产品；生物组织自动包埋机（TBFL1型）为武汉天之瑞医疗科技有限公司产品；真空自动脱水机（HYTS1090B型）、半自动石蜡切片机（HY3500型）和摊烤片机（HYHP型）均为金华惠友仪器设备有限公司产品。
目录
缩略词表...........I
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words2
引言2
1 材料与方法2
1.1 试验材料 2
1.1.1 样品采集2
1.1.2 试验用细胞、鸭胚和实验动物2
1.1.3 主要仪器设备和耗材2
1.1.4 主要试剂...... *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
.....3
1.2 试验方法 3
1.2.1 病毒分离..3
1.2.2 分子生物学鉴定3
1.2.3 序列分析3
1.2.4 电镜观察3
1.2.5 部分生物学特性鉴定3
1.2.6 部分理化特性鉴定4
2 结果与分析5
2.1 病毒分离5
2.2 病毒鉴定5
2.2.1 分子生物学鉴定5
2.2.2 序列分析.5
2.2.3 电镜观察..7
2.2.4 部分生物学特性鉴定7
2.2.5 部分理化特性鉴定13
3 讨论14
致谢16
参考文献16 缩略词表
英文缩写
英文全称
中文对照
ARV
Avian Reovirus
禽呼肠孤病毒
CEF
Chicken Embryo Fibroblast
鸡胚成纤维细胞
CEL
Chicken Embryo Liver cell
鸡胚肝细胞
d
date
天
DRV
Duck Reovirus
鸭呼肠孤病毒
ELD50
Embryo Lethal Dose 50
胚半数致死量
g
gram
克
h
hour
小时
LMH
Leghorn Malechicken Hepatocellular carcinoma
鸡肝癌细胞系
MDRV
Muscovy Duck Reovirus
番鸭呼肠孤病毒
mg
milligram
毫克
mL
milliliter
毫升
min
minute
分
NDRV
Novel Duck Reovirus
新型鸭呼肠孤病毒
PCR
Polymerase Chain Reaction
聚合酶链反应
rpm
rotation per min
转每分钟
s
second
秒
TCID50
Tissue Culture Infective Dose 50
组织细胞培养半数感染量
μg
microgram
微克
μl
microliter
微升
新型鸭呼肠孤病毒的分离与鉴定
引言
自1997年以来，在中国福建、浙江、广东等番鸭养殖省暴发了一种以软脚为主要临床症状，以肝、脾表面有多量白点为主要病理变化的“番鸭肝白点病”[1]。2001年，福建农林大学首次分离并鉴定了该病病原为呼肠孤病毒科、正呼肠孤病毒属、番鸭呼肠孤病毒[2]。近年来，半番鸭、北京鸭和野鸭等多品种鸭都陆续出现了感染和发病，其临床表现差异很大，主要表现为免疫抑制和生长障碍等，通过分离和鉴定均证实为新型鸭呼肠孤病毒（Novel Duck Reovirus，NDRV）[36]。新型鸭呼肠孤病毒感染已成为近几年在全国各地鸭养殖区流行发生的一种危害严重的传染病。
我们于2017年9月至12月，自广西、山东、广东及江苏等地的养鸭场采集到一批以樱桃谷肉鸭、番鸭为感染对象，年龄主要集中于5 ~ 20日龄，具有典型的肝脾坏死特征的疑似DRV感染的病变肝脏、脾脏等样品。通过形态学观察、生物学特性和理化特性测定以及σC基因序列分析等方面，了解新型鸭呼肠孤病毒的病原特点及致病特征，为禽呼肠孤病毒的流行病学调查和分类提供素材，继而为有效防控鸭呼肠孤病毒病提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 样品采集 2017年9月 ~ 12月自广西、山东、广东及江苏等省的养鸭场采集的5份疑似DRV感染病鸭的病变肝脏、脾脏等样品；鸭呼肠孤阳性对照株由天津渤海农牧产业联合研究院有限公司惠赠。
1.1.2 试验用细胞、鸭胚和实验动物 LMH细胞购自ATCC细胞库；1日龄肉鸭胚、1日龄肉鸭均购自河北安新无呼肠孤病毒感染的某鸭场；1日龄SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。
1.1.3 主要仪器设备和耗材 电脑孵化设备（600IB型）为北京海江孵化设备制造有限公司产品；生物安全柜（NU4256000S型）为美国Nuaire公司产品；生化培养箱（SPX250型）为宁波市科技园区新江南仪器有限公司产品；超低温冰箱（EXF24086V型）为Thermo Scientific Revco公司产品；XSP37XB三目倒置生物显微镜（DSZLV320型）为上海川翔生物科技有限公司产品；正置显微镜（CIL型）为上海Nikon仪器有限公司产品；CO2 恒温培养箱（INC153型）为德国memmert有限公司产品；梯度PCR扩增仪（T100型）为美国BioRad 公司产品；凝胶成像分析系统（GELDOCXR+型）为美国BioRad公司产品；电泳仪、水平电泳槽（DYY6D型）为北京市六一仪器厂产品；生物组织自动包埋机（TBFL1型）为武汉天之瑞医疗科技有限公司产品；真空自动脱水机（HYTS1090B型）、半自动石蜡切片机（HY3500型）和摊烤片机（HYHP型）均为金华惠友仪器设备有限公司产品。
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