犬吉氏巴贝斯虫分离株trap基因遗传多样性分析
：本研究的主要目的是对南京地区自然感染的犬吉氏巴贝斯虫TRAP基因进行克隆并对该基因进行测序分析。从大学动物医院采集了15份疑似犬巴贝斯虫病病犬的血液，提取基因组DNA。首先对犬巴贝斯虫18S rDNA进行PCR扩增，确诊患病犬是否感染了犬巴贝斯虫。然后采用PCR方法扩增犬巴贝斯虫TRAP基因，并对PCR产物进行测序，分析南京地区流行的犬巴贝斯虫与GenBank中公布的基因序列的同源性。结果从15例疑似感染犬巴贝斯虫病犬血液DNA中检测到10例犬巴贝斯虫18S rDNA基因片段，即这10个病例为犬巴贝斯虫感染。选择其中3例（NJN1，NJN2 NJN3）对TRAP基因进行测序，测序分析显示南京分离株NJN 1和NJN 2 TRAP基因同源性较高，达99.9%。NJN 1、NJN 2 与NJN3之间TRAP基因序列有一定的差异，同源性分别为98.8%（NJN 1 vs NJN 3）98.7%（NJN 2 vs NJN 3）。与亚洲地区其他国家分离株比较显示：南京分离株与台湾分离株和日本分离株亲缘关系较近，同源性为（97%-99.4%），与印度和孟加拉国分离株亲缘关系较远（86.7-94.1%）。这些结果表明TRAP基因适合于犬吉氏巴贝斯基因分型。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1.1 临床病料采集 2
1.2 血液基因组DNA提取 2
1.3 犬巴贝斯虫18S rDNA鉴定 2
1.4 犬巴贝斯虫TRAP基因的扩增和测序分析 2
2 结果与分析 3
2.1 犬巴贝斯虫18S rDNA鉴定 3
2.2 犬巴贝斯虫TRAP基因的扩增 3
2.3 犬巴贝斯虫TRAP基因序列分析 4
3 讨论 8
致谢 9
参考文献 10
犬吉氏巴贝斯虫南京分离株TRAP基因序列分析
引言
犬巴贝斯虫病是由梨形虫目（Piroplasmida）巴贝斯科（Babesiidae）、巴贝斯属（Babesia），是一种蜱传播的寄生虫[1]，该寄生
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
虫寄生于犬的红细胞内，它可以引起犬巴贝斯虫病。据报道该病在很多地区流行传播，包括亚洲[25]，非洲[6,7]，美国[8, 9]，澳大利亚[10]，欧洲[11,12]，美洲[13]。犬巴贝斯虫病的临床表现包括弛张热，渐进性溶血性贫血，血红蛋白尿和脾脏肿大，严重的情况可以导致犬的死亡[14,15]。最近几年，这种疾病在犬身上频繁的发现，在一些流行性地区引发了一系列严重的临床问题[4,16]，然而并没有有效的疫苗用于犬巴贝斯虫病的预防。
尽管巴贝斯虫是全球性分布并且非常具有研究价值的寄生虫，但是目前很少有相关数据关于吉氏巴贝斯虫在不同地理区域虫株的遗传多样性报道和系统发生的记载。迄今为止，关于吉氏巴贝斯虫分子流行病学的研究大多是集中在18S rDNA上。然而，目前现有的数据表明，吉氏巴贝斯虫的18S rDNA高度保守，在遗传多样性的分析上只能提供有限的信息[3,12]。因此，关于吉氏巴贝斯虫的遗传多样性的研究，18S rDNA可能不是一个理想的研究靶基因。
凝血酶致敏相关粘附蛋白（thrombospondinrelated adhesive protein，TRAP）是顶复体分泌的具有很强免疫原性的蛋白分子[17]，与吉氏巴贝斯虫入侵红细胞的生物学过程密切相关，这种蛋白质在候选疫苗中表现出了良好的研究前景，这种疫苗针对吉氏巴贝斯虫的传染有一定的防控作用[2,18]。对于这种抗原候选者的序列变异研究可以帮助阐明吉氏巴贝斯虫虫株的差异，对于研制出有效的血清学诊断试剂的发展和犬巴贝斯虫病的疫苗研究奠定了基础。近年来，台湾Lee等[19]比较了台湾地区犬感染的吉氏巴贝斯虫18S rDNA和之前报道过的相关基因数据，结果发现台湾地区犬巴贝斯虫分离株和之前日本冲绳岛分离虫株数据很接近，但是从TRAP基因方面却和日本的本州岛、韩国的济州岛的分离株之间有一定的区别。
本试验我们将运用PCR技术扩增TRAP基因，并对该基因进行测序和分析，研究在南京地区自然感染犬的犬吉氏巴贝斯虫TRAP基因的多样性。
1 材料与方法
1.1 临床病料采集
2015年9月至2015年11月期间，就诊于大学动物医院的病犬，临床上表现为贫血，血涂片镜检观察有可疑的犬巴贝斯虫虫体。采集15份病犬的血液。血样收集于含有EDTA的无菌试管中，保存于4℃直到送到实验室做进一步处理。
1.2 血液基因组DNA提取
采用蛋白酶K消化、苯酚抽提的方法提取出血液中总的基因组DNA[20]。取100 μL的待检血样，加入400 μL裂解液，震荡混匀。于37℃温浴30 min，然后向其加入5 μL的蛋白酶K（20 mg/mL），于55℃消化2 h。之后加入等体积的苯酚，混匀，室温下12000 g离心10 min。再取上清至新的离心管内，加入0.2倍体积的10 mol/L的醋酸铵和2倍体积的无水乙醇，混合均匀后12000 g离心5 min。弃上清，向离心管内加入1 mL 75%的乙醇，12000 g离心5 min。弃上清，再离心2 min，吸掉多余的乙醇，之后干燥。最后加入30 μL的TE溶解DNA，并在20℃下保存备用。
1.3 犬巴贝斯虫18S rDNA鉴定
参考姚大伟[21]发表的论文进行犬巴贝斯虫PCR鉴定，上游引物B.com 339F 5gtcttgtaattggaatgatggtgac3，下游引物B.com 339R 5atgcccccaaccgttcctatta3，该引物能够扩增出339 bp的犬巴贝斯虫18S rDNA基因片段。PCR反应体系如下：2×Taq PCR Mix 12.5 μL，上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，下游引物（10 μmol/L）0.5 μL，DNA模板10.5 μL补水至25 μL。PCR扩增条件如下：①95℃预变性5 min，②95℃变性15 s，③56℃退火 15 s，④72℃延伸30 s，⑤72℃延伸5 min。②④重复30个循环。PCR产物在混有Goldview的2%琼脂糖凝胶中进行电泳。
1.4 犬巴贝斯虫TRAP基因的扩增和测序分析
参考Lee[19]发表的论文进行犬巴贝斯虫TRAP基因扩增，上游引物TRAP F 5GCATCTGGGAAAAATCGAGCC3，下游引物TRAP R 5TCTATCTGCGATGTCCCTT GT3，该引物能够扩增出2303 bp的犬巴贝斯虫TRAP基因片段。PCR反应体系同1.3。PCR扩增条件72℃延伸2 min，其他同1.3。PCR产物在混有Goldview的1.2%琼脂糖凝胶中进行电泳。
PCR产物进行纯化，使用的方法是普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒。首先把的TRAP DNA从琼脂糖凝胶上尽可能多的切下，然后放入试剂盒的离心管中，称取凝胶重量。之后加入等体积的PN试剂，50℃水浴加热，期间不断上下翻转离心管，确保琼脂糖凝胶的充分溶解。可以加长放置时间或者再添加溶胶液，来溶解没有溶化的琼脂糖凝胶，直到离心管中的琼脂糖凝胶完全溶解。将凝胶溶解的溶液加入一个吸附柱CA2中，室温下静置2 min，12000 g离心60 s，然后倒掉收集管中离心出的液体，将吸附柱CA2放入收集管中。之后再向吸附柱CA2中加入600 μL漂洗液PW试剂，12000 g离心60 s，然后倒掉收集管中离心出的液体，再将吸附柱放入收集管中。之后重复上一个步骤，再向之前的吸附柱中加入600 μL漂洗液PW试剂，12000 g离心30~60 s，倒掉收集管中的离心出的液体，将吸附柱放入收集管中，再12000 g离心2 min。使漂洗液尽可能的除尽。为了防止残留的漂洗液影响下一步的实验结果，需要将吸附柱于室温放置数分钟，彻底晾干。把彻底晾干的吸附柱放在一个干净的离心管中，滴加30 μL EB试剂，室温放置2 min，12000 g离心2 min，收集回收得到的DNA。然后送至英潍捷基（上海）贸易有限公司进行测序。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1.1 临床病料采集 2
1.2 血液基因组DNA提取 2
1.3 犬巴贝斯虫18S rDNA鉴定 2
1.4 犬巴贝斯虫TRAP基因的扩增和测序分析 2
2 结果与分析 3
2.1 犬巴贝斯虫18S rDNA鉴定 3
2.2 犬巴贝斯虫TRAP基因的扩增 3
2.3 犬巴贝斯虫TRAP基因序列分析 4
3 讨论 8
致谢 9
参考文献 10
犬吉氏巴贝斯虫南京分离株TRAP基因序列分析
引言
犬巴贝斯虫病是由梨形虫目（Piroplasmida）巴贝斯科（Babesiidae）、巴贝斯属（Babesia），是一种蜱传播的寄生虫[1]，该寄生
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
虫寄生于犬的红细胞内，它可以引起犬巴贝斯虫病。据报道该病在很多地区流行传播，包括亚洲[25]，非洲[6,7]，美国[8, 9]，澳大利亚[10]，欧洲[11,12]，美洲[13]。犬巴贝斯虫病的临床表现包括弛张热，渐进性溶血性贫血，血红蛋白尿和脾脏肿大，严重的情况可以导致犬的死亡[14,15]。最近几年，这种疾病在犬身上频繁的发现，在一些流行性地区引发了一系列严重的临床问题[4,16]，然而并没有有效的疫苗用于犬巴贝斯虫病的预防。
尽管巴贝斯虫是全球性分布并且非常具有研究价值的寄生虫，但是目前很少有相关数据关于吉氏巴贝斯虫在不同地理区域虫株的遗传多样性报道和系统发生的记载。迄今为止，关于吉氏巴贝斯虫分子流行病学的研究大多是集中在18S rDNA上。然而，目前现有的数据表明，吉氏巴贝斯虫的18S rDNA高度保守，在遗传多样性的分析上只能提供有限的信息[3,12]。因此，关于吉氏巴贝斯虫的遗传多样性的研究，18S rDNA可能不是一个理想的研究靶基因。
凝血酶致敏相关粘附蛋白（thrombospondinrelated adhesive protein，TRAP）是顶复体分泌的具有很强免疫原性的蛋白分子[17]，与吉氏巴贝斯虫入侵红细胞的生物学过程密切相关，这种蛋白质在候选疫苗中表现出了良好的研究前景，这种疫苗针对吉氏巴贝斯虫的传染有一定的防控作用[2,18]。对于这种抗原候选者的序列变异研究可以帮助阐明吉氏巴贝斯虫虫株的差异，对于研制出有效的血清学诊断试剂的发展和犬巴贝斯虫病的疫苗研究奠定了基础。近年来，台湾Lee等[19]比较了台湾地区犬感染的吉氏巴贝斯虫18S rDNA和之前报道过的相关基因数据，结果发现台湾地区犬巴贝斯虫分离株和之前日本冲绳岛分离虫株数据很接近，但是从TRAP基因方面却和日本的本州岛、韩国的济州岛的分离株之间有一定的区别。
本试验我们将运用PCR技术扩增TRAP基因，并对该基因进行测序和分析，研究在南京地区自然感染犬的犬吉氏巴贝斯虫TRAP基因的多样性。
1 材料与方法
1.1 临床病料采集
2015年9月至2015年11月期间，就诊于大学动物医院的病犬，临床上表现为贫血，血涂片镜检观察有可疑的犬巴贝斯虫虫体。采集15份病犬的血液。血样收集于含有EDTA的无菌试管中，保存于4℃直到送到实验室做进一步处理。
1.2 血液基因组DNA提取
采用蛋白酶K消化、苯酚抽提的方法提取出血液中总的基因组DNA[20]。取100 μL的待检血样，加入400 μL裂解液，震荡混匀。于37℃温浴30 min，然后向其加入5 μL的蛋白酶K（20 mg/mL），于55℃消化2 h。之后加入等体积的苯酚，混匀，室温下12000 g离心10 min。再取上清至新的离心管内，加入0.2倍体积的10 mol/L的醋酸铵和2倍体积的无水乙醇，混合均匀后12000 g离心5 min。弃上清，向离心管内加入1 mL 75%的乙醇，12000 g离心5 min。弃上清，再离心2 min，吸掉多余的乙醇，之后干燥。最后加入30 μL的TE溶解DNA，并在20℃下保存备用。
1.3 犬巴贝斯虫18S rDNA鉴定
参考姚大伟[21]发表的论文进行犬巴贝斯虫PCR鉴定，上游引物B.com 339F 5gtcttgtaattggaatgatggtgac3，下游引物B.com 339R 5atgcccccaaccgttcctatta3，该引物能够扩增出339 bp的犬巴贝斯虫18S rDNA基因片段。PCR反应体系如下：2×Taq PCR Mix 12.5 μL，上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，下游引物（10 μmol/L）0.5 μL，DNA模板10.5 μL补水至25 μL。PCR扩增条件如下：①95℃预变性5 min，②95℃变性15 s，③56℃退火 15 s，④72℃延伸30 s，⑤72℃延伸5 min。②④重复30个循环。PCR产物在混有Goldview的2%琼脂糖凝胶中进行电泳。
1.4 犬巴贝斯虫TRAP基因的扩增和测序分析
参考Lee[19]发表的论文进行犬巴贝斯虫TRAP基因扩增，上游引物TRAP F 5GCATCTGGGAAAAATCGAGCC3，下游引物TRAP R 5TCTATCTGCGATGTCCCTT GT3，该引物能够扩增出2303 bp的犬巴贝斯虫TRAP基因片段。PCR反应体系同1.3。PCR扩增条件72℃延伸2 min，其他同1.3。PCR产物在混有Goldview的1.2%琼脂糖凝胶中进行电泳。
PCR产物进行纯化，使用的方法是普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒。首先把的TRAP DNA从琼脂糖凝胶上尽可能多的切下，然后放入试剂盒的离心管中，称取凝胶重量。之后加入等体积的PN试剂，50℃水浴加热，期间不断上下翻转离心管，确保琼脂糖凝胶的充分溶解。可以加长放置时间或者再添加溶胶液，来溶解没有溶化的琼脂糖凝胶，直到离心管中的琼脂糖凝胶完全溶解。将凝胶溶解的溶液加入一个吸附柱CA2中，室温下静置2 min，12000 g离心60 s，然后倒掉收集管中离心出的液体，将吸附柱CA2放入收集管中。之后再向吸附柱CA2中加入600 μL漂洗液PW试剂，12000 g离心60 s，然后倒掉收集管中离心出的液体，再将吸附柱放入收集管中。之后重复上一个步骤，再向之前的吸附柱中加入600 μL漂洗液PW试剂，12000 g离心30~60 s，倒掉收集管中的离心出的液体，将吸附柱放入收集管中，再12000 g离心2 min。使漂洗液尽可能的除尽。为了防止残留的漂洗液影响下一步的实验结果，需要将吸附柱于室温放置数分钟，彻底晾干。把彻底晾干的吸附柱放在一个干净的离心管中，滴加30 μL EB试剂，室温放置2 min，12000 g离心2 min，收集回收得到的DNA。然后送至英潍捷基（上海）贸易有限公司进行测序。
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