嗜水气单胞菌nj35株luxs基因缺失株的构建及特性分析
嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）为革兰阴性杆菌，广泛分布于各种水体环境中，是导致淡水鱼败血症的主要病原，其致病力受到多种毒力因子的调控。其中密度感应系统是调控细菌毒力的一个重要因素。本研究为了探索密度感应系统相关基因luxS的生物学功能，在自杀性质粒pYAK1的基础上，运用同源重组技术，构建了嗜水气单胞菌NJ-35的luxS基因的缺失株，采用穿梭质粒pMMB207构建了互补株，并对其部分生物学特性进行了分析。研究结果表明，luxS基因缺失后，其生长能力并没有明显变化，但其生物被膜形成能力显著降低，此结果说明luxS基因在嗜水气单胞菌生物被膜形成过程中起着重要的作用，但其具体致病机制还需要后续研究。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法1
1.1 质粒与菌株2
1.2 主要试剂及仪器 2
1.3 嗜水气单胞菌NJ35株luxS基因缺失株的构建与鉴定2
1.3.1 luxS基因上下游的扩增 2
1.3.2 luxS基因上下游的融合 3
1.3.3 重组质粒PYAK1的构建3
1.3.4 接合及缺失株的鉴定 4
1.4 嗜水气单胞菌NJ35株luxS基因互补株的构建与鉴定5
1.4.1 luxS基因的扩增5
1.4.2 质粒PMMB201的构建6
1.4.3 接合及互补株的鉴定7
1.5 嗜水气单胞菌NJ35株luxS基因缺失株与互补株生长曲线的测定7
1.6 嗜水气单胞菌NJ35株luxS基因缺失株与互补株生物被膜形成能力的测定7
2 结果与分析7
2.1 嗜水气单胞菌NJ35株luxS基因缺失株的构建与鉴定7
2.1.1 luxS基因上下游片段的扩增7
2.1.2 luxS基因上下游同源臂的融合8
2.1.3 质粒pYAK1的酶切回收8
2.1.4 重组质粒的鉴定8
2.1.5 接合单交换的鉴定9
2.1 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
.6 接合双交换的鉴定9
2.1.7 缺失株的鉴定 10
2.2 嗜水气单胞菌NJ35株luxS基因缺失株的构建与鉴定10
2.2.1 luxS基因的扩增10
2.2.2 质粒PMMB201的酶切回收10
2.2.3 重组质粒的鉴定11
2.2.4 接合鉴定11
2.3 嗜水气单胞菌NJ35株luxS基因缺失株与互补株性质的鉴定12
2.3.1 生长曲线的测定12
2.3.2 生物被膜生成能力的测定12
3 讨论13
致谢13
参考文献13
嗜水气单胞菌NJ35株luxS基因缺失株的构建及特性分析
引言
嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）隶属气单胞菌科（Aeromonadaceae）气单胞菌属（Aeromonas），是一种革兰氏阴性杆菌。它广泛分布在自然界的各种水体中，如湖泊、河流、井水、地下水、污水等[1]。嗜水气单胞菌是条件致病菌，有着广泛的致病性，是典型的人兽鱼共患病病原菌[2]。嗜水气单胞菌可以引发鱼类爆发性的出血症，而且也能引起人的急性肠胃炎、败血症以及伤口感染等。嗜水气单胞菌的致病机制复杂，其致病性受到黏附因子、胞外产物、分泌系统、群体感应系统等多种毒力因子的调控作用[8]，且各毒力因子之间可以相互作用，协同调控细菌致病力[3]。
密度感应（Quorum Sensing，QS）是一种基因表达调控机制，广泛存在于革兰阳性和革兰阴性菌中[4]，它是指细菌可以感应彼此散发的信号分子产物而介导细胞间通讯的过程。研究表明，细菌会产生AI信号分子，它随着细菌浓度的增加而增加[5]，当细菌浓度到达阈值时，AI和细菌表面的信号受体蛋白相结合，调控相应基因表达。LuxS蛋白酶作用于AI2的合成，LuxS蛋白酶由luxS基因编码[6]。细菌可以通过信号分子感应自身的数量，并据此调节自身基因的表达，进而产生特定的行为，如生物发光、控制毒力因子的分泌、生物被膜或芽孢的形成等[7]。
为了研究密度感应系统对嗜水气单胞菌致病性的影响，我们采用同源重组技术构建了luxS基因缺失株和互补株，并测定了luxS基因的缺失对嗜水气单胞菌生物被膜形成能力和生长能力的影响，为后续探索嗜水气单胞菌的致病机制打下了基础。
材料与方法
1.1 质粒与菌株 嗜水气单胞菌NJ35由本实验室分离保存，大肠杆菌SM10由本实验室购买并保存，质粒 pYAK1 及 pMMB207 均由浙江大学方维焕教授馈赠。大肠杆菌培养温度为37℃，嗜水气单胞菌培养温度为28℃，均用LB培养基。
1.2 主要培养基、试剂及仪器 LB液体培养基（10% 胰蛋白胨、 10% 氯化钠及 5% 酵母提取物）。PrimeSTAR DNA 聚合酶、限制性内切酶、DNA Marker购自大连 TaKaRa 公司；ClonExpress II One Step Cloning Kit 同源重组酶、2×PCR PreMix南京诺唯赞生物科技有限公司；细菌质粒提取试剂盒、胶回收纯化试剂盒购自OMEGA 公司。其余试剂均为进口或国产分析纯。高速冷冻离心机（Sorvail）、温度梯度PCR仪（Biometra T Gradient）、DNA电泳仪（北京六一）、凝胶成像系统（BioRad）、酶标仪（MultiskanGO，Thermo Scientific）、分光光度计（SmartSpec Plus）。
1.3 嗜水气单胞菌NJ35株luxS基因缺失株的构建与鉴定
1.3.1 luxS基因上下游片段的扩增
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法1
1.1 质粒与菌株2
1.2 主要试剂及仪器 2
1.3 嗜水气单胞菌NJ35株luxS基因缺失株的构建与鉴定2
1.3.1 luxS基因上下游的扩增 2
1.3.2 luxS基因上下游的融合 3
1.3.3 重组质粒PYAK1的构建3
1.3.4 接合及缺失株的鉴定 4
1.4 嗜水气单胞菌NJ35株luxS基因互补株的构建与鉴定5
1.4.1 luxS基因的扩增5
1.4.2 质粒PMMB201的构建6
1.4.3 接合及互补株的鉴定7
1.5 嗜水气单胞菌NJ35株luxS基因缺失株与互补株生长曲线的测定7
1.6 嗜水气单胞菌NJ35株luxS基因缺失株与互补株生物被膜形成能力的测定7
2 结果与分析7
2.1 嗜水气单胞菌NJ35株luxS基因缺失株的构建与鉴定7
2.1.1 luxS基因上下游片段的扩增7
2.1.2 luxS基因上下游同源臂的融合8
2.1.3 质粒pYAK1的酶切回收8
2.1.4 重组质粒的鉴定8
2.1.5 接合单交换的鉴定9
2.1 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
.6 接合双交换的鉴定9
2.1.7 缺失株的鉴定 10
2.2 嗜水气单胞菌NJ35株luxS基因缺失株的构建与鉴定10
2.2.1 luxS基因的扩增10
2.2.2 质粒PMMB201的酶切回收10
2.2.3 重组质粒的鉴定11
2.2.4 接合鉴定11
2.3 嗜水气单胞菌NJ35株luxS基因缺失株与互补株性质的鉴定12
2.3.1 生长曲线的测定12
2.3.2 生物被膜生成能力的测定12
3 讨论13
致谢13
参考文献13
嗜水气单胞菌NJ35株luxS基因缺失株的构建及特性分析
引言
嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）隶属气单胞菌科（Aeromonadaceae）气单胞菌属（Aeromonas），是一种革兰氏阴性杆菌。它广泛分布在自然界的各种水体中，如湖泊、河流、井水、地下水、污水等[1]。嗜水气单胞菌是条件致病菌，有着广泛的致病性，是典型的人兽鱼共患病病原菌[2]。嗜水气单胞菌可以引发鱼类爆发性的出血症，而且也能引起人的急性肠胃炎、败血症以及伤口感染等。嗜水气单胞菌的致病机制复杂，其致病性受到黏附因子、胞外产物、分泌系统、群体感应系统等多种毒力因子的调控作用[8]，且各毒力因子之间可以相互作用，协同调控细菌致病力[3]。
密度感应（Quorum Sensing，QS）是一种基因表达调控机制，广泛存在于革兰阳性和革兰阴性菌中[4]，它是指细菌可以感应彼此散发的信号分子产物而介导细胞间通讯的过程。研究表明，细菌会产生AI信号分子，它随着细菌浓度的增加而增加[5]，当细菌浓度到达阈值时，AI和细菌表面的信号受体蛋白相结合，调控相应基因表达。LuxS蛋白酶作用于AI2的合成，LuxS蛋白酶由luxS基因编码[6]。细菌可以通过信号分子感应自身的数量，并据此调节自身基因的表达，进而产生特定的行为，如生物发光、控制毒力因子的分泌、生物被膜或芽孢的形成等[7]。
为了研究密度感应系统对嗜水气单胞菌致病性的影响，我们采用同源重组技术构建了luxS基因缺失株和互补株，并测定了luxS基因的缺失对嗜水气单胞菌生物被膜形成能力和生长能力的影响，为后续探索嗜水气单胞菌的致病机制打下了基础。
材料与方法
1.1 质粒与菌株 嗜水气单胞菌NJ35由本实验室分离保存，大肠杆菌SM10由本实验室购买并保存，质粒 pYAK1 及 pMMB207 均由浙江大学方维焕教授馈赠。大肠杆菌培养温度为37℃，嗜水气单胞菌培养温度为28℃，均用LB培养基。
1.2 主要培养基、试剂及仪器 LB液体培养基（10% 胰蛋白胨、 10% 氯化钠及 5% 酵母提取物）。PrimeSTAR DNA 聚合酶、限制性内切酶、DNA Marker购自大连 TaKaRa 公司；ClonExpress II One Step Cloning Kit 同源重组酶、2×PCR PreMix南京诺唯赞生物科技有限公司；细菌质粒提取试剂盒、胶回收纯化试剂盒购自OMEGA 公司。其余试剂均为进口或国产分析纯。高速冷冻离心机（Sorvail）、温度梯度PCR仪（Biometra T Gradient）、DNA电泳仪（北京六一）、凝胶成像系统（BioRad）、酶标仪（MultiskanGO，Thermo Scientific）、分光光度计（SmartSpec Plus）。
1.3 嗜水气单胞菌NJ35株luxS基因缺失株的构建与鉴定
1.3.1 luxS基因上下游片段的扩增
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