小鼠骨髓源树突状细胞的分离和培养
小鼠骨髓源树突状细胞的分离和培养[20200507190021]
摘要：树突状细胞（Dendritic cell，DC）被认为是最有效的抗原提呈细胞。本试验旨在用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素 (Interleukin, IL-4) 诱导小鼠骨髓前体细胞分化为树突状细胞，建立一种体外诱导培养小鼠髓源树突状细胞的方法。通过形态学观察、细胞表型分析，对小鼠髓源树突状细胞的体外诱导培养进行鉴定。实验结果显示，培养3天的细胞有大量集落生成，第6天可见到典型形态的DC。收集第7天的细胞悬液，流式细胞术检测细胞表型，发现培养细胞中62.1%具有CD11c表面标志，CD80为15.2%，MHC Ⅱ为64.4%。结果表明该方法能培育出较高纯度的树突状细胞。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
关键字:树突状细胞；培养；细胞因子,流式细胞术
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料和设备 2
1.1.1实验动物2
1.1.2 实验主要试剂2
1.1.3试剂配制2
1.1.4仪器和设备2
1.2方法 3
1.2.1 小鼠骨髓源DC的分离培养3
1.2.2 流式细胞分析仪检测小鼠髓源树突状细胞的表型4
2 结果和分析4
2.1 体外培养小鼠髓源树突状细胞的光镜观察 4
2.2 流式细胞分析仪检测小鼠髓源树突状细胞的表型 5
3 讨论6
致谢7
参考文献7
小鼠髓源树突状细胞的分离和培养
引言
1973年Steinman和Cohn[1]首次从小鼠脾组织中分离发现分离出一类与粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞不同，形态、功能均极为特殊的免疫细胞,命名为树突状细胞(Dendritic cell, DC)。此后DC逐渐成为人们研究的热点，获得一定量有功能的DC是深入研究其生物学功能的前提和关键。但DC作为一种微量细胞，在体内分布散在，在动物和人外周血中尚不足白细胞总量的1%。分离及纯化比较困难，这妨碍了对其形态、结构及功能进一步研究。
自从Inaba等于1992年首用重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (granulocyte -macrophage colony-stimulating-factor，GM-CSF)从小鼠骨髓中大规模培养制备 DC 的方法[2]后，DC的功能才逐步被发现。DC在免疫应答的首要环节-抗原提呈中起到非常重要的作 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
用，是目前公认的体内抗原提呈功能最强的专职抗原呈递细胞(antigen presenting cells, APC)。机体内的DC大部分处于非成熟状态，具有极强的内吞功能，抗原被DC摄取后，经过MHCⅡ类分子的处理、加工，形成抗原多肽。虽然DC在体内含量甚微,仅占外周单个核细胞的0.1%～0.5%，但其分布广泛，抗原提呈能力是巨噬细胞的10～100倍[3]。DC不仅是目前已知功能最强的抗原呈递细胞，也是唯一能启动初始T细胞和B细胞的一类细胞，它在机体抗肿瘤、抗感染、移植排斥及自身免疫性疾病的预防与治疗中发挥着重要作用[4]。
我们一般将具有典型树突状形态且膜表面高表达MHCⅡ类分子，能迁移至淋巴器官，可刺激初始型T细胞增殖活化，具有一些相对特异性表面标志的一类细胞称为DC[5]。DC并不是一个均一的群体，但所有的DC均来源于骨髓干细胞，不论是组织DC还是培养DC，不论是人DC还是小鼠DC，均可区分为非成熟和成熟两个阶段[6]。未成熟的DC的主要特征为细胞表面突起较短,细胞表面低水平表达MHC-Ⅱ类分子和共刺激分子CD80、CD86等，具有较强的抗原捕获和处理能力，但刺激混合淋巴细胞反应的能力较弱。成熟DC主要特征为细胞表面有大量细长突起且有分支；细胞表面高表达MHC-Ⅱ类分子和共刺激分子CD80、CD86等[7]。
本研究从小鼠骨髓中获取树突状细胞的前体细胞，然后在GM-CSF和IL-4细胞因子的作用下培养出树突状细胞，通过光学显微镜和流式细胞术检测相对特异性表面标志分析鉴别DC及其成熟阶段，为以后培养定成熟阶段的DC研究其功能奠定基础。
1 材料与方法
1．1 材料和设备
1．1．1 实验动物 品种：SPF级C57BL/6 小鼠，6周，雌性，购自南京医科大学实验动物中心 常规饲养。
1．1．2 实验主要试剂
1640干粉 购自美国 Gibco 公司
胎牛血清 购自美国 Gibco 公司
GM-CSF 购自美国 RD 公司
IL-4 购自美国 RD 公司
Anti-Mouse CD11c PE 购自美国 eBioscience 公司
Rat IgG2b K Iso Control PE 购自美国 eBioscience 公司
Anti-Mouse CD80 PE 购自美国 eBioscience 公司
Anti-Mouse MHCⅡ(I-A/I-E) PE 购自美国 eBioscience 公司
Arm Hamster IgG Iso Control PE 购自美国 eBioscience 公司
1．1．3试剂配制
1.1.3.1 无菌PBS溶液： 准确称量KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，NaCl 8.0g，Na2HPO4 ?2H2O 1.5 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
6g，分别加入去离子水中充分溶解，并定容至 1000mL然后将 PH 值调至 7.2-7.4，分装后在高压锅中121℃，20分钟消毒即可。
1.1.3.2 10%RPMI-1640 完全培养液： 将一整包1640干粉溶解于超纯水中，然后准确称量2.0g NaHCO3并加入超纯水中充分溶解，定容至1L，调节PH至7.2左右。用0.22um的微孔滤膜过滤成无菌液体并按每瓶90mL的量分装保存于4℃冰箱。待用时每瓶加入10mL胎牛血清和GM-CSF、IL-4 各10 ng/mL。
1.1.3.3 4%多聚甲醛的配合： 用PBS配制，取100ml PBS，准确称量0.4g多聚甲醛加入100ml PBS中，水浴加热低于60℃，搅拌至溶解用2N NaOH，调节PH到7.4，然后用
0.22um的微孔滤膜过滤成无菌液体，做好标记，4℃保存。
1．1．4仪器设备
80ml广口瓶、手术剪、小镊子、小平皿、高压纱布、2ml注射器若干、干烤离心管（10ml）、离心管架、5ml移液管、废液缸、一次性六孔细胞培养板、超净工作台、CO2培养箱、台式高速低温离心机、微量移液器、电子天平、流式细胞仪
1．2 方法
1.2.1小鼠骨髓源DC 的分离及体外培养
①提前煮沸手术剪、镊子消毒30分钟，所用器材置于超净台紫外照射30分钟。
②取40mL75%酒精倒入广口瓶中。将C57BL/6雌性小鼠颈椎脱位法处死后置于75%酒精中浸泡5分钟。
摘要：树突状细胞（Dendritic cell，DC）被认为是最有效的抗原提呈细胞。本试验旨在用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素 (Interleukin, IL-4) 诱导小鼠骨髓前体细胞分化为树突状细胞，建立一种体外诱导培养小鼠髓源树突状细胞的方法。通过形态学观察、细胞表型分析，对小鼠髓源树突状细胞的体外诱导培养进行鉴定。实验结果显示，培养3天的细胞有大量集落生成，第6天可见到典型形态的DC。收集第7天的细胞悬液，流式细胞术检测细胞表型，发现培养细胞中62.1%具有CD11c表面标志，CD80为15.2%，MHC Ⅱ为64.4%。结果表明该方法能培育出较高纯度的树突状细胞。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
关键字:树突状细胞；培养；细胞因子,流式细胞术
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料和设备 2
1.1.1实验动物2
1.1.2 实验主要试剂2
1.1.3试剂配制2
1.1.4仪器和设备2
1.2方法 3
1.2.1 小鼠骨髓源DC的分离培养3
1.2.2 流式细胞分析仪检测小鼠髓源树突状细胞的表型4
2 结果和分析4
2.1 体外培养小鼠髓源树突状细胞的光镜观察 4
2.2 流式细胞分析仪检测小鼠髓源树突状细胞的表型 5
3 讨论6
致谢7
参考文献7
小鼠髓源树突状细胞的分离和培养
引言
1973年Steinman和Cohn[1]首次从小鼠脾组织中分离发现分离出一类与粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞不同，形态、功能均极为特殊的免疫细胞,命名为树突状细胞(Dendritic cell, DC)。此后DC逐渐成为人们研究的热点，获得一定量有功能的DC是深入研究其生物学功能的前提和关键。但DC作为一种微量细胞，在体内分布散在，在动物和人外周血中尚不足白细胞总量的1%。分离及纯化比较困难，这妨碍了对其形态、结构及功能进一步研究。
自从Inaba等于1992年首用重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (granulocyte -macrophage colony-stimulating-factor，GM-CSF)从小鼠骨髓中大规模培养制备 DC 的方法[2]后，DC的功能才逐步被发现。DC在免疫应答的首要环节-抗原提呈中起到非常重要的作 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
用，是目前公认的体内抗原提呈功能最强的专职抗原呈递细胞(antigen presenting cells, APC)。机体内的DC大部分处于非成熟状态，具有极强的内吞功能，抗原被DC摄取后，经过MHCⅡ类分子的处理、加工，形成抗原多肽。虽然DC在体内含量甚微,仅占外周单个核细胞的0.1%～0.5%，但其分布广泛，抗原提呈能力是巨噬细胞的10～100倍[3]。DC不仅是目前已知功能最强的抗原呈递细胞，也是唯一能启动初始T细胞和B细胞的一类细胞，它在机体抗肿瘤、抗感染、移植排斥及自身免疫性疾病的预防与治疗中发挥着重要作用[4]。
我们一般将具有典型树突状形态且膜表面高表达MHCⅡ类分子，能迁移至淋巴器官，可刺激初始型T细胞增殖活化，具有一些相对特异性表面标志的一类细胞称为DC[5]。DC并不是一个均一的群体，但所有的DC均来源于骨髓干细胞，不论是组织DC还是培养DC，不论是人DC还是小鼠DC，均可区分为非成熟和成熟两个阶段[6]。未成熟的DC的主要特征为细胞表面突起较短,细胞表面低水平表达MHC-Ⅱ类分子和共刺激分子CD80、CD86等，具有较强的抗原捕获和处理能力，但刺激混合淋巴细胞反应的能力较弱。成熟DC主要特征为细胞表面有大量细长突起且有分支；细胞表面高表达MHC-Ⅱ类分子和共刺激分子CD80、CD86等[7]。
本研究从小鼠骨髓中获取树突状细胞的前体细胞，然后在GM-CSF和IL-4细胞因子的作用下培养出树突状细胞，通过光学显微镜和流式细胞术检测相对特异性表面标志分析鉴别DC及其成熟阶段，为以后培养定成熟阶段的DC研究其功能奠定基础。
1 材料与方法
1．1 材料和设备
1．1．1 实验动物 品种：SPF级C57BL/6 小鼠，6周，雌性，购自南京医科大学实验动物中心 常规饲养。
1．1．2 实验主要试剂
1640干粉 购自美国 Gibco 公司
胎牛血清 购自美国 Gibco 公司
GM-CSF 购自美国 RD 公司
IL-4 购自美国 RD 公司
Anti-Mouse CD11c PE 购自美国 eBioscience 公司
Rat IgG2b K Iso Control PE 购自美国 eBioscience 公司
Anti-Mouse CD80 PE 购自美国 eBioscience 公司
Anti-Mouse MHCⅡ(I-A/I-E) PE 购自美国 eBioscience 公司
Arm Hamster IgG Iso Control PE 购自美国 eBioscience 公司
1．1．3试剂配制
1.1.3.1 无菌PBS溶液： 准确称量KCl 0.2g，KH2PO4 0.2g，NaCl 8.0g，Na2HPO4 ?2H2O 1.5 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
6g，分别加入去离子水中充分溶解，并定容至 1000mL然后将 PH 值调至 7.2-7.4，分装后在高压锅中121℃，20分钟消毒即可。
1.1.3.2 10%RPMI-1640 完全培养液： 将一整包1640干粉溶解于超纯水中，然后准确称量2.0g NaHCO3并加入超纯水中充分溶解，定容至1L，调节PH至7.2左右。用0.22um的微孔滤膜过滤成无菌液体并按每瓶90mL的量分装保存于4℃冰箱。待用时每瓶加入10mL胎牛血清和GM-CSF、IL-4 各10 ng/mL。
1.1.3.3 4%多聚甲醛的配合： 用PBS配制，取100ml PBS，准确称量0.4g多聚甲醛加入100ml PBS中，水浴加热低于60℃，搅拌至溶解用2N NaOH，调节PH到7.4，然后用
0.22um的微孔滤膜过滤成无菌液体，做好标记，4℃保存。
1．1．4仪器设备
80ml广口瓶、手术剪、小镊子、小平皿、高压纱布、2ml注射器若干、干烤离心管（10ml）、离心管架、5ml移液管、废液缸、一次性六孔细胞培养板、超净工作台、CO2培养箱、台式高速低温离心机、微量移液器、电子天平、流式细胞仪
1．2 方法
1.2.1小鼠骨髓源DC 的分离及体外培养
①提前煮沸手术剪、镊子消毒30分钟，所用器材置于超净台紫外照射30分钟。
②取40mL75%酒精倒入广口瓶中。将C57BL/6雌性小鼠颈椎脱位法处死后置于75%酒精中浸泡5分钟。
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