猪卵母细胞成熟过程中auroraa的动态表达与细胞骨架分布的相关性分析
目的 探讨Aurora-A激酶在猪卵母细胞成熟过程中的动态表达与细胞骨架分布的相关性，为进一步研究Aurora-A在猪卵母细胞成熟分裂过程中的作用提供依据。方法 采用间接免疫荧光技术，并结合激光共聚焦显微镜技术，检测Aurora-A蛋白的表达与亚细胞定位，然后分别使用Aurora-A特异性抑制剂（MLN-8054）、微管蛋白抑制剂（秋水仙素）处理猪卵母细胞，研究Aurora-A与细胞骨架分布的相关性。结果 在GV期， Aurora-A主要均匀分布在细胞质中，生发泡破裂(GVBD)后， Aurora-A主要伴随着纺锤体表达，并随着纺锤体的装配和染色体的分离而发生相应的迁移；使用Aurora-A特异性抑制剂MLN-8054处理细胞后，与对照组相比，细胞阻滞在MI期的比例显著增加（P<0.05），细胞发育成熟的比例显著降低（P<0.05），同时微丝断裂、分散和纺锤体形态异常的比例增加；使用秋水仙素处理细胞后，(-微管蛋白以一种异常的形式分布在染色体周围或消失，而Aurora-A蛋白或以异常形态伴随纺锤体表达，或消失。结论 猪卵母细胞成熟分裂过程中Aurora-A的动态表达在与微丝、微管的分布有着明显的相关性，Aurora-A可能对猪卵母细胞的成熟具有重要调控作用。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料2
1.1主要仪器设备 2
1.2主要试剂及药品 2
1.3试剂配制3
2 方法4
2.1猪卵母细胞采集与成熟培养4
2.2间接免疫荧光染色4
2.3激光共聚焦显微镜观察5
2.4 实验设计5
2.5 数据处理 5
3 结果5
3.1 猪卵母细胞成熟分裂过程中细胞骨架的动态表达5
3.2 猪卵母细胞成熟分裂过程中AuroraA的亚细胞定位6
3.3猪卵母细胞成熟分裂过程中AuroraA与atubulin的共定位7
3.4 AuroraA特异性抑制剂对猪卵母细胞成熟的影响8
3.5 AuroraA特异性抑制剂对细胞骨架的影响9
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
/> 3.6 秋水仙素处理对AuroraA表达与定位的影响11
4 讨论12
4.1 AuroraA的定位及其与αtubulin的共定位12
4.2 AuroraA特异性抑制剂对猪卵母细胞成熟的影响13
4.3 AuroraA特异性抑制剂对卵母细胞骨架的影响13
4.4 秋水仙素处理对AuroraA表达与定位的影响13
致谢13
参考文献14
猪卵母细胞成熟过程中AuroraA的动态表达与细胞骨架
分布的相关性分析
引言
Aurora 激酶是一组高度保守的细胞周期蛋白激酶，参与调控细胞有丝分裂进程中中心体的复制、两极纺锤体的形成、染色体的浓集和分离及染色体检查点检测等重要过程[1]。哺乳动物中，Aurora 激酶包括三种亚型，即AuroraA、 Aurora–B和AuroraC，其家族成员蛋白结构相似，C端催化区相对保守，N端调控区长度多变。AuroraA在中心体的分离过程中发挥重要调控作用，果蝇AuroraA发生突变时，中心体分离缺陷，产生单极纺锤体[2]。另外，细胞体外培养的研究发现，在AuroraA表达异常时，会引起中心体扩增，而且其扩增不依赖AuroraA激酶的活性[34]。在有丝分裂过程中，AuroraA主要通过RanGTPase信号通路，对纺锤体的装配发挥重要的调控作用[5]，在AuroraA激酶失活的突变体中，纺锤体的形成受到破坏[6]。另外有研究表明，某些类型的肿瘤，其生物学行为与AuroraA的表达水平有着明显的相关性[7]，Aurora A在多种癌症中，如胃癌[8]、乳腺癌[9]、肝癌[10]等普遍过表达[11]，用RNA 干扰敲除AuroraA 会导致纺锤体缺乏，有丝分裂延迟和细胞凋亡[12]。已有研究表明，在小鼠卵母细胞中，AuroraA是表达量最高的亚型, 在减数分裂期间尤其是分裂中期，定位于纺锤体， Aurora 激酶的活性被抑制后，会导致染色体分离异常，对减数分裂过程造成负性影响[13]。在牛卵母细胞减数分裂过程中，AuroraA、AuroraB 的转录水平均显著增加, 且主要表达亚型是AuroraA [14]，在大鼠精子中，用Aurora抑制剂ZM447439处理，精子减数分裂过程中纺锤体形态发生变化，染色体错误排列[15]。Aurora 激酶在小鼠、爪蟾以及牛卵母细胞减数分裂和成熟过程中有重要调节作用[1617]。那么，在猪卵母细胞成熟过程中，AuroraA是否也有同样重要的功能？研究AuroraA 激酶对猪卵母细胞成熟分裂的调控，对于进一步认识生殖发育机理，提高卵母细胞质量和动物胚胎体外生产效率，具有重要的意义。本实验旨在研究AuroraA在猪卵母细胞成熟分裂过程中的动态表达及其与细胞骨架分布的时间与空间的相关性，为进一步了解猪卵母细胞成熟过程中的分子机制提供实验依据。
1 材料
1.1 主要仪器设备
电子天平：FA1104N,上海精密科学仪器有限公司
CO2培养箱：Thermo,Forma3111
实体显微镜：SMZ10，Nikon公司
荧光倒置显微镜：T1SM，Nikon公司
自动双重纯水蒸馏仪：D1810C,上海申顺生物科技有限公司
定时恒温磁力搅拌器：ML902，绍兴市卫星医疗制备制造有限公司
电热恒温干燥箱：PYXDHS40X5085，上海跃进医疗器械厂
电热恒温水浴锅：HHS2，上海浦东荣丰科学仪器有限公司
双人单面超净工作台：SWCJ2FD，苏州净化设备厂
精密PH计：PHS3S，上海雷磁仪器厂
台式离心机：TDL802B，上海安亭科技仪器厂
压力蒸汽灭菌器：YXQ.SG41.280，上海华线医用核子仪器有限公司
精密恒温控制仪：南京凯尔仪器有限公司
4孔板：NUNC公司
KEL2000型显微镜温控仪：南京凯尔仪器有限公司
移卵针自制
1.2 主要试剂及药品
KCl：SIGMA，批号：101171052
NaCl：：SIGMA，批号：020205
KH2PO4：SIGMA，批号：101259274
Na2HPO412H2O：西陇化工股份有限公司，批号：1207031
硫酸链霉素：江苏南农高科动物药业有限公司，批号：20130105
青霉素钠：河北远征药业有限公司，批号：B6L130505
TCM199：GIBCO，批号：31100035
孕马血清促性腺激素（PMSG）：宁波第二激素厂，批号：150209
人绒毛膜促性腺激素（hCG）：宁波第二激素厂，批号：141205
丙酮酸钠：SIGMA，批号：1001131344
葡萄糖：SIGMA，批号：101197270
牛血清白蛋白（BSA，Fraction V）：上海思吉生物制品有限公司，批号：120901
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料2
1.1主要仪器设备 2
1.2主要试剂及药品 2
1.3试剂配制3
2 方法4
2.1猪卵母细胞采集与成熟培养4
2.2间接免疫荧光染色4
2.3激光共聚焦显微镜观察5
2.4 实验设计5
2.5 数据处理 5
3 结果5
3.1 猪卵母细胞成熟分裂过程中细胞骨架的动态表达5
3.2 猪卵母细胞成熟分裂过程中AuroraA的亚细胞定位6
3.3猪卵母细胞成熟分裂过程中AuroraA与atubulin的共定位7
3.4 AuroraA特异性抑制剂对猪卵母细胞成熟的影响8
3.5 AuroraA特异性抑制剂对细胞骨架的影响9
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
/> 3.6 秋水仙素处理对AuroraA表达与定位的影响11
4 讨论12
4.1 AuroraA的定位及其与αtubulin的共定位12
4.2 AuroraA特异性抑制剂对猪卵母细胞成熟的影响13
4.3 AuroraA特异性抑制剂对卵母细胞骨架的影响13
4.4 秋水仙素处理对AuroraA表达与定位的影响13
致谢13
参考文献14
猪卵母细胞成熟过程中AuroraA的动态表达与细胞骨架
分布的相关性分析
引言
Aurora 激酶是一组高度保守的细胞周期蛋白激酶，参与调控细胞有丝分裂进程中中心体的复制、两极纺锤体的形成、染色体的浓集和分离及染色体检查点检测等重要过程[1]。哺乳动物中，Aurora 激酶包括三种亚型，即AuroraA、 Aurora–B和AuroraC，其家族成员蛋白结构相似，C端催化区相对保守，N端调控区长度多变。AuroraA在中心体的分离过程中发挥重要调控作用，果蝇AuroraA发生突变时，中心体分离缺陷，产生单极纺锤体[2]。另外，细胞体外培养的研究发现，在AuroraA表达异常时，会引起中心体扩增，而且其扩增不依赖AuroraA激酶的活性[34]。在有丝分裂过程中，AuroraA主要通过RanGTPase信号通路，对纺锤体的装配发挥重要的调控作用[5]，在AuroraA激酶失活的突变体中，纺锤体的形成受到破坏[6]。另外有研究表明，某些类型的肿瘤，其生物学行为与AuroraA的表达水平有着明显的相关性[7]，Aurora A在多种癌症中，如胃癌[8]、乳腺癌[9]、肝癌[10]等普遍过表达[11]，用RNA 干扰敲除AuroraA 会导致纺锤体缺乏，有丝分裂延迟和细胞凋亡[12]。已有研究表明，在小鼠卵母细胞中，AuroraA是表达量最高的亚型, 在减数分裂期间尤其是分裂中期，定位于纺锤体， Aurora 激酶的活性被抑制后，会导致染色体分离异常，对减数分裂过程造成负性影响[13]。在牛卵母细胞减数分裂过程中，AuroraA、AuroraB 的转录水平均显著增加, 且主要表达亚型是AuroraA [14]，在大鼠精子中，用Aurora抑制剂ZM447439处理，精子减数分裂过程中纺锤体形态发生变化，染色体错误排列[15]。Aurora 激酶在小鼠、爪蟾以及牛卵母细胞减数分裂和成熟过程中有重要调节作用[1617]。那么，在猪卵母细胞成熟过程中，AuroraA是否也有同样重要的功能？研究AuroraA 激酶对猪卵母细胞成熟分裂的调控，对于进一步认识生殖发育机理，提高卵母细胞质量和动物胚胎体外生产效率，具有重要的意义。本实验旨在研究AuroraA在猪卵母细胞成熟分裂过程中的动态表达及其与细胞骨架分布的时间与空间的相关性，为进一步了解猪卵母细胞成熟过程中的分子机制提供实验依据。
1 材料
1.1 主要仪器设备
电子天平：FA1104N,上海精密科学仪器有限公司
CO2培养箱：Thermo,Forma3111
实体显微镜：SMZ10，Nikon公司
荧光倒置显微镜：T1SM，Nikon公司
自动双重纯水蒸馏仪：D1810C,上海申顺生物科技有限公司
定时恒温磁力搅拌器：ML902，绍兴市卫星医疗制备制造有限公司
电热恒温干燥箱：PYXDHS40X5085，上海跃进医疗器械厂
电热恒温水浴锅：HHS2，上海浦东荣丰科学仪器有限公司
双人单面超净工作台：SWCJ2FD，苏州净化设备厂
精密PH计：PHS3S，上海雷磁仪器厂
台式离心机：TDL802B，上海安亭科技仪器厂
压力蒸汽灭菌器：YXQ.SG41.280，上海华线医用核子仪器有限公司
精密恒温控制仪：南京凯尔仪器有限公司
4孔板：NUNC公司
KEL2000型显微镜温控仪：南京凯尔仪器有限公司
移卵针自制
1.2 主要试剂及药品
KCl：SIGMA，批号：101171052
NaCl：：SIGMA，批号：020205
KH2PO4：SIGMA，批号：101259274
Na2HPO412H2O：西陇化工股份有限公司，批号：1207031
硫酸链霉素：江苏南农高科动物药业有限公司，批号：20130105
青霉素钠：河北远征药业有限公司，批号：B6L130505
TCM199：GIBCO，批号：31100035
孕马血清促性腺激素（PMSG）：宁波第二激素厂，批号：150209
人绒毛膜促性腺激素（hCG）：宁波第二激素厂，批号：141205
丙酮酸钠：SIGMA，批号：1001131344
葡萄糖：SIGMA，批号：101197270
牛血清白蛋白（BSA，Fraction V）：上海思吉生物制品有限公司，批号：120901
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