H7亚型禽流感病毒HA基因的原核表达(2)
H7亚型禽流感病毒HA基因的原核表达(2)[20200507192037]
摘要：禽流感病毒属甲型流感病毒，根据2种表面蛋白血凝素和神经氨酸酶的抗原性分为不同亚型。从NCBI下载A/Hangzhou/1/2013(H7N9)株HA全基因序列，由生物技术公司合成HA基因，并将其插入pET28a(+)中，构建pET28a(+)-HA重组质粒，将pET28a(+)-HA转化进入感受态大肠杆菌BL21和Rosetta菌中获得重组细胞。经IPTG诱导获得高效表达，超声破碎后，收集上清和沉淀，经SDS-PAGE电泳结果显示HA蛋白主要以包涵体的形式存在。Western bolt 结果表明重组蛋白具有良好的免疫学活性。
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关键字:甲型流感病毒；HA基因；原核表达
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3材料与方法4 1.1 材料4
1.1.1 pET28a载体质粒、细胞 4
1.1.2 重组质粒的制备4
1.1.3 工具酶4
1.1.4 试剂4
1.1.5 相关仪器5
1.2 方法5
1.2.1 重组质粒双酶切鉴定5
1.2.2 BL21感受态细胞的制备5
1.2.3 质粒导入感受态细胞5
1.2.4 细菌的培养及诱导表达5
1.2.4.1 阳性菌落的扩增5
1.2.4.2 阴性对照扩增6
1.2.4.3 IPTG诱导表达6
1.2.5 SDS-PAGE电泳鉴定6
1.2.6 重组蛋白的抗原性分析6
1.2.6.1 SDS-PAGE电泳6
1.2.6.2 半干转膜6
1.2.6.3 封闭6
1.2.6.4 与一抗作用6
1.2.6.5 与二抗作用6
1.2.7 显色6
2 结果与分析6
2.1 重组质粒与空载体酶切鉴定7
2.2 重组基因的诱导表达7
2.2.1 重组质粒在BL21中的表达7
2.2.2 重组质粒在Rosetta中的表达7
2.3 Western-Blot 鉴定 8
讨论9致谢9参考文献9图1 重组质粒pET28a(+)-HA和pET28a空载体酶切图7
图2 重组质粒在BL21中的表达7
图3 重组细菌 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
裂解8
图4 重组蛋白的Western-blot鉴定（HIS单抗）8
图5 重组蛋白的Western-blot鉴定（H7阳性血清）9
H7亚型禽流感病毒HA基因的原核表达
引言
流感病毒（influenza virus， IV）是正黏膜病毒科流感病毒属成员，根据病毒粒子中NP和M蛋白的抗原差异，分为甲（A）、乙（B）、丙（C）3型，其中甲型流感病毒的抗原变异性最强，可以感染哺乳动物和鸟类，引起中度和重度疾病，侵袭所有年龄段动物，常引起世界性大流行[1-5]。甲型流感病毒又根据2种表面蛋白血凝素（hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（neuraminidase，NA）的抗原性分为不同亚型，已证明HA有16个亚型，NA至少有9个亚型。其中H1N1、H2N2、H3N2亚型主要感染人类，其他多种亚型的自然宿主是禽类和其他动物，其中对禽类危害最大的为H5、H7和H9亚型毒株[1-5]。禽源H5N1、H9N2、H7N7和H10N7等均有感染人的报道，血清学证据表明H4、H6和H11亚型禽流感病毒（AIV）也可能感染过人。截止2013年之前，约发生11人感染H7亚型流感病毒，涉及国家为美国、澳大利亚、英国、意大利、荷兰和加拿大，约112人感染，鉴定为H7N2、H7N3和H7N7亚型，其中只有2003年荷兰一位兽医感染H7N7 AIV亚型毒株死亡[6]。2013年3月31日，中国发现人感染H7N9流感病毒疫情，目前正是第一例于2月中旬在上海，截止5月2日，确诊127例，分布于中国台湾和大陆10个省（市），其中确诊死亡26例[7]。
甲型流感病毒在增殖过程中很容易产生变异和基因或片段重组，同时由于RNA聚合酶缺乏校正功能，在病毒基因组复制时容易出现错误，致使流感病毒的抗原性、致病性比其他RNA病毒更容易发生变化[1]。HA是流感病毒基因组中变异最频繁的基因之一，发生在HA受体结合位点上的突变可能会改变病毒宿主特异性，而HA上糖基化位点的突变则有可能导致病毒毒力发生根本变化[8]。甲型流感病毒的8个RNA节段中，节段4编码血凝素HA。HA属于Ⅰ型膜糖蛋白，是流感病毒最重要的表面蛋白。新合成的HA在粗面内质网中进行糖基化，并在通过内质网时切除氨基端含14～18个氨基酸的信号肽。HA以同源三聚体的形式突出在囊膜表面，呈棒状，由球形的头部和颈部组成，其中球部在HA1亚单位内，包括受体结合位点和大部分的抗原位点；颈部由全部HA2和部分HA1亚单位组成。HA 是流感病毒的主要表面抗原，能诱导机体产生保护性中和抗体[9-13]。这些抗体可以通过病毒中和试验或HI试验测定。检测鸡血清样品中H7N9抗体能有助于了解鸡群的感染情况，可以用中和试验或血凝抑制（HI）试验来检测抗体。
本研究拟通过构建禽流感病毒HA基因的原核表达质粒，在BL21和Rosetta菌中诱导表达HA蛋白，Western blot 检测其反应原性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 pET28a载体质粒、细胞
pET28a载体质粒及BL21、Rosetta菌为本实验室保存。
1.1.2 重组质粒的制备
将质粒和载体送至上海杰瑞生物公司合成。
1.1.3 工具酶
限 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
制性内切酶BamHI和XhoI。
1.1.4 试剂
50xTAE Buffer：称取Tris 242g，Na2EDTA12H2O 37.2g，向烧杯中加入800ml去离子水，充分搅拌溶解，再加入57.1ml乙酸，搅拌均匀后用去离子水将溶液定容至1L后，室温保存。
LB液体培养基： Tryptone (胰蛋白胨) 10g，Nacl 10g，Yeast Extract 5g，加去离子水至1L，高压灭菌，室温保存。
LB固体培养基：Tryptone（胰蛋白胨）5g， Nacl 5g，Yeast Extract 2.5g，琼脂粉7.5g，加去离子水至500ml，高压灭菌。凉至55℃左右，加入400ul浓度为50mg/ml的氨苄霉素。若用于重组Rosetta菌的培养，则还需要加氯霉素。摇匀后浇于培养皿中，放置超净台中凝固，然后4℃保存。
0.1M Cacl2配制：称取1.11gCacl2，加入100mlddH2O，摇匀后高压灭菌。
IPTG（24mg/ml）：称取1.2gIPTG加入50ml离心管中，再加入40ml灭菌水，充分摇匀后，定容至50ml，用0.22um滤器过滤，分装。-20℃保存。
1xPBS：称取KCl 0.2g，NaCl 8g，Na2HPO4.12H2O 3.58g，KH2PO4 0.27g，加入800mlddH2O,用HCL调PH至7.4，加水至1L，高压灭菌。
氨苄霉素的配制：称取氨苄霉素0.5g，加去离子水至10ml，再用0.22um的滤膜过滤，分装，-20℃保存。
PBST（万分之五吐温）： Tween20(吐温) 2.5ml，PBS 5L，混匀。
5XSDS-PAGE Loading buffer：分别称取1M Tris-HCL(PH6.8) 2.5ml，溴酚蓝50ml，甘油5.0ml，SDS 1.0g，β-巯基乙醇 0.5g，加去离子水定容至10ml。
APS(10%过硫酸铵)：称取过硫酸铵0.1g加蒸馏水1ml，充分溶解。
摘要：禽流感病毒属甲型流感病毒
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关键字:甲型流感病毒；HA基因；原核表达
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摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3材料与方法4 1.1 材料4
1.1.1 pET28a载体质粒、细胞 4
1.1.2 重组质粒的制备4
1.1.3 工具酶4
1.1.4 试剂4
1.1.5 相关仪器5
1.2 方法5
1.2.1 重组质粒双酶切鉴定5
1.2.2 BL21感受态细胞的制备5
1.2.3 质粒导入感受态细胞5
1.2.4 细菌的培养及诱导表达5
1.2.4.1 阳性菌落的扩增5
1.2.4.2 阴性对照扩增6
1.2.4.3 IPTG诱导表达6
1.2.5 SDS-PAGE电泳鉴定6
1.2.6 重组蛋白的抗原性分析6
1.2.6.1 SDS-PAGE电泳6
1.2.6.2 半干转膜6
1.2.6.3 封闭6
1.2.6.4 与一抗作用6
1.2.6.5 与二抗作用6
1.2.7 显色6
2 结果与分析6
2.1 重组质粒与空载体酶切鉴定7
2.2 重组基因的诱导表达7
2.2.1 重组质粒在BL21中的表达7
2.2.2 重组质粒在Rosetta中的表达7
2.3 Western-Blot 鉴定 8
讨论9致谢9参考文献9图1 重组质粒pET28a(+)-HA和pET28a空载体酶切图7
图2 重组质粒在BL21中的表达7
图3 重组细菌 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
裂解8
图4 重组蛋白的Western-blot鉴定（HIS单抗）8
图5 重组蛋白的Western-blot鉴定（H7阳性血清）9
H7亚型禽流感病毒HA基因的原核表达
引言
流感病毒（influenza virus， IV）是正黏膜病毒科流感病毒属成员，根据病毒粒子中NP和M蛋白的抗原差异，分为甲（A）、乙（B）、丙（C）3型，其中甲型流感病毒的抗原变异性最强，可以感染哺乳动物和鸟类，引起中度和重度疾病，侵袭所有年龄段动物，常引起世界性大流行[1-5]。甲型流感病毒又根据2种表面蛋白血凝素（hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（neuraminidase，NA）的抗原性分为不同亚型，已证明HA有16个亚型，NA至少有9个亚型。其中H1N1、H2N2、H3N2亚型主要感染人类，其他多种亚型的自然宿主是禽类和其他动物，其中对禽类危害最大的为H5、H7和H9亚型毒株[1-5]。禽源H5N1、H9N2、H7N7和H10N7等均有感染人的报道，血清学证据表明H4、H6和H11亚型禽流感病毒（AIV）也可能感染过人。截止2013年之前，约发生11人感染H7亚型流感病毒，涉及国家为美国、澳大利亚、英国、意大利、荷兰和加拿大，约112人感染，鉴定为H7N2、H7N3和H7N7亚型，其中只有2003年荷兰一位兽医感染H7N7 AIV亚型毒株死亡[6]。2013年3月31日，中国发现人感染H7N9流感病毒疫情，目前正是第一例于2月中旬在上海，截止5月2日，确诊127例，分布于中国台湾和大陆10个省（市），其中确诊死亡26例[7]。
甲型流感病毒在增殖过程中很容易产生变异和基因或片段重组，同时由于RNA聚合酶缺乏校正功能，在病毒基因组复制时容易出现错误，致使流感病毒的抗原性、致病性比其他RNA病毒更容易发生变化[1]。HA是流感病毒基因组中变异最频繁的基因之一，发生在HA受体结合位点上的突变可能会改变病毒宿主特异性，而HA上糖基化位点的突变则有可能导致病毒毒力发生根本变化[8]。甲型流感病毒的8个RNA节段中，节段4编码血凝素HA。HA属于Ⅰ型膜糖蛋白，是流感病毒最重要的表面蛋白。新合成的HA在粗面内质网中进行糖基化，并在通过内质网时切除氨基端含14～18个氨基酸的信号肽。HA以同源三聚体的形式突出在囊膜表面，呈棒状，由球形的头部和颈部组成，其中球部在HA1亚单位内，包括受体结合位点和大部分的抗原位点；颈部由全部HA2和部分HA1亚单位组成。HA 是流感病毒的主要表面抗原，能诱导机体产生保护性中和抗体[9-13]。这些抗体可以通过病毒中和试验或HI试验测定。检测鸡血清样品中H7N9抗体能有助于了解鸡群的感染情况，可以用中和试验或血凝抑制（HI）试验来检测抗体。
本研究拟通过构建禽流感病毒HA基因的原核表达质粒，在BL21和Rosetta菌中诱导表达HA蛋白，Western blot 检测其反应原性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 pET28a载体质粒、细胞
pET28a载体质粒及BL21、Rosetta菌为本实验室保存。
1.1.2 重组质粒的制备
将质粒和载体送至上海杰瑞生物公司合成。
1.1.3 工具酶
限 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
制性内切酶BamHI和XhoI。
1.1.4 试剂
50xTAE Buffer：称取Tris 242g，Na2EDTA12H2O 37.2g，向烧杯中加入800ml去离子水，充分搅拌溶解，再加入57.1ml乙酸，搅拌均匀后用去离子水将溶液定容至1L后，室温保存。
LB液体培养基： Tryptone (胰蛋白胨) 10g，Nacl 10g，Yeast Extract 5g，加去离子水至1L，高压灭菌，室温保存。
LB固体培养基：Tryptone（胰蛋白胨）5g， Nacl 5g，Yeast Extract 2.5g，琼脂粉7.5g，加去离子水至500ml，高压灭菌。凉至55℃左右，加入400ul浓度为50mg/ml的氨苄霉素。若用于重组Rosetta菌的培养，则还需要加氯霉素。摇匀后浇于培养皿中，放置超净台中凝固，然后4℃保存。
0.1M Cacl2配制：称取1.11gCacl2，加入100mlddH2O，摇匀后高压灭菌。
IPTG（24mg/ml）：称取1.2gIPTG加入50ml离心管中，再加入40ml灭菌水，充分摇匀后，定容至50ml，用0.22um滤器过滤，分装。-20℃保存。
1xPBS：称取KCl 0.2g，NaCl 8g，Na2HPO4.12H2O 3.58g，KH2PO4 0.27g，加入800mlddH2O,用HCL调PH至7.4，加水至1L，高压灭菌。
氨苄霉素的配制：称取氨苄霉素0.5g，加去离子水至10ml，再用0.22um的滤膜过滤，分装，-20℃保存。
PBST（万分之五吐温）： Tween20(吐温) 2.5ml，PBS 5L，混匀。
5XSDS-PAGE Loading buffer：分别称取1M Tris-HCL(PH6.8) 2.5ml，溴酚蓝50ml，甘油5.0ml，SDS 1.0g，β-巯基乙醇 0.5g，加去离子水定容至10ml。
APS(10%过硫酸铵)：称取过硫酸铵0.1g加蒸馏水1ml，充分溶解。
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