chodg4423g10的商业化培养基驯化筛选及营养补充优化(附件)
CHO-DG44-23G10细胞能生产抗人肿瘤坏死因子(TNF)的人源化单克隆抗体，生产过程中宿主细胞的产物表达水平主要受培养基和培养工艺的影响。本实验对该细胞系对各种商业培养基驯化培养，通过对活细胞密度、细胞活力、细胞倍增、蛋白表达量、生产速率等参数的监测比较，最终筛选出该细胞系在CD FortiCHOTM培养基中表达速率最高，可进行进一步优化。通过测定培养液上清中的葡萄糖浓度，间歇补加葡萄糖，初步建立基于葡萄糖的动态流加培养过程。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法4
1.1材料 4
1.1.1细胞株4
1.1.2培养基4
1.1.3仪器与耗材4
1.1.4实验试剂4
1.2方法 4
1.2.1试验方法4
1.2.2分析方法5
2结果与分析6
2.1细胞驯化6
2.2产量测试及糖的补加6
2.2.1细胞生长曲线6
2.2.2蛋白表达量8
2.2.3糖的补加9
3讨论 10
致谢10
参考文献10
CHODG4423G10的商业化培养基驯化筛选优化及葡萄糖补加
引言
CHODG4423G10细胞，是一种能生产抗人肿瘤坏死因子(TNF)的人源化单克隆抗体的细胞，这种单克隆抗体临床上能减轻炎症反应并减少破骨细胞激活，达到控制并缓解症状体征的目的[1]。近年来，相关产品在医学市场需求量巨大，有着很大的商业前景。随着基因工程的发展，宿主细胞的产物表达水平、生产规模以及培养模式的局限阻碍了生物药物在中国市场的推广。与上世纪80年代相比，哺乳动物细胞培养工艺取得了巨大的进步，批次培养的时间可以达到10天，而流加培养更是可以达到21天，最高细胞密度可以达到1x108 Cells/mL，重组蛋白总产量可以达到15 g/L[23]。这主要是归功于培养基和培养工艺的优化，以及细胞系和表达载体的筛选，而培养工艺优化则对这些进步的取得扮演关
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键角色[45]。
对于培养基而言，90% 以上的企业仍以使用商业培养基为主。本实验拟对CHODG4423G10细胞系通过对细胞进行驯化培养，使其逐渐适应不同培养基。培养过程中，细胞对葡萄糖的消耗速率是所有营养物质中最高的，需确保葡萄糖在培养过程中处于相对稳定的浓度而不被快速耗竭[6]。以葡萄糖为关键控制参数，通过离线计数、测定培养液上清中的葡萄糖浓度，间歇补加葡萄糖。培养结束将培养上清离心，测定蛋白表达情况，来对这些培养基进一步的筛选，优化培养工艺，从而建立起基于葡萄糖的动态流加培养过程，选出最为合适的培养基，对进一步的放大生产进行指导。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 细胞株 CHODG4423G10中国仓鼠卵巢细胞 (Chinese hamster ovary,CHO)，表达人肿瘤坏死因子的人源化单克隆抗体，由凯惠睿智生物科技（上海）有限公司提供，前期筛选在CD FortiCHOTM Medium中。
1．1．2 培养基 无血清培养基CD FortiCHOTM Medium购自Gibco公司；无血清培养基HyCell CHO TMMedium购自Hyclone公司；无血清培养基CHO CD07Medium购自上海奥浦迈生物科技有限公司；无血清培养基CellventoTM CHO 210Medium购自Millipore公司；无血清培养基CHO CD022Medium购自甘肃健顺生物科技有限公司公司。
1．1．2 仪器与耗材 二氧化碳振荡培养箱（Kuhner/ ISF1XC）；生物安全柜（Thermo/1300 SERIES A2）；countstar细胞自动计数仪(COUNT STAT)；离心机(Eppendorf/5810R)；乳酸葡萄糖双功能分析仪（山东省科学院生物研究所/ SBA40C）；振荡培养瓶（corning/125 mL/250 mL）；BioRad 15mL重力层析柱（BioRad/#7321010）；层析介质MabSelect SuRe（GE#17543803）；NanoDrop 2000超微量分光光度计（Thermo）；倒置显微镜（NIKON公司）；0.22 um 微量过滤器（Millipore）；Dionex U3000高效液相色谱仪（DIONEX）；蛋白A亲和层析柱（Life Technologies/2.1mmD*30 mmH,104ul）。
1．1．2 实验试剂 Lglutamine 购自Gibco公司；培养基补料CD Efficient Feed AGTTM购自Gibco公司；培养基补料Cell Boost 5TM购自Hyclone公司；培养基补料CDF06V5购自上海奥浦迈生物科技有限公司；培养基补料CellventoTM Feed 210购自Millipore公司；Buffer A：20 mM PB(PH7.0)，Buffer B：20 mM 柠檬酸缓冲溶液(PH3.5)，Buffer C：1.0 M TrisHCl缓冲溶液(PH8.5)，以上三种缓冲溶液均由由凯惠睿智生物科技（上海）有限公司纯化组提供；台盼蓝购自Sigma公司；葡萄糖购自国药集团化学试剂有限公司；20*PBS(中久科技有限公司)；GlyHCL（上海凌峰化学试剂有限公司）。
1．2 方法
1．2．1 试验方法
1．2．1 .1 细胞复苏 从液氮罐中取出冻存的细胞置于干冰中，遵循“慢冻速溶”原则。于37℃水浴槽中快速融化。低速离心后吸出上清液，使用新鲜的相应培养基（CD FortiCHOTM）进行细胞重悬，以35x105 Cell/mL的密度，接种30 mL于125 mL的振荡培养瓶中进行培养，二氧化碳振荡培养箱条件为温度37℃，转速130 rpm，CO2浓度8%。
复苏接种后每天取样进行细胞计数，显微镜下观察细胞形态，确定有无微生物污染，当密度达到35x106 Cell/mL时，以35x105 Cell/mL的接种密度进行传代，维持细胞活率大于95%。 至少传代23次，细胞倍增时间稳定，才可进行下步实验。
1．2．1 .2 细胞株驯化 将稳定生长于CD FortiCHOTM培养基的细胞进行扩大培养至所需量。按照50%、100%的比例逐步驯化到适应目的培养基HyCell CHO TMMedium、CHO CD07Medium、CellventoTM CHO 210Medium、CHO CD022Medium[7]。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法4
1.1材料 4
1.1.1细胞株4
1.1.2培养基4
1.1.3仪器与耗材4
1.1.4实验试剂4
1.2方法 4
1.2.1试验方法4
1.2.2分析方法5
2结果与分析6
2.1细胞驯化6
2.2产量测试及糖的补加6
2.2.1细胞生长曲线6
2.2.2蛋白表达量8
2.2.3糖的补加9
3讨论 10
致谢10
参考文献10
CHODG4423G10的商业化培养基驯化筛选优化及葡萄糖补加
引言
CHODG4423G10细胞，是一种能生产抗人肿瘤坏死因子(TNF)的人源化单克隆抗体的细胞，这种单克隆抗体临床上能减轻炎症反应并减少破骨细胞激活，达到控制并缓解症状体征的目的[1]。近年来，相关产品在医学市场需求量巨大，有着很大的商业前景。随着基因工程的发展，宿主细胞的产物表达水平、生产规模以及培养模式的局限阻碍了生物药物在中国市场的推广。与上世纪80年代相比，哺乳动物细胞培养工艺取得了巨大的进步，批次培养的时间可以达到10天，而流加培养更是可以达到21天，最高细胞密度可以达到1x108 Cells/mL，重组蛋白总产量可以达到15 g/L[23]。这主要是归功于培养基和培养工艺的优化，以及细胞系和表达载体的筛选，而培养工艺优化则对这些进步的取得扮演关
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
键角色[45]。
对于培养基而言，90% 以上的企业仍以使用商业培养基为主。本实验拟对CHODG4423G10细胞系通过对细胞进行驯化培养，使其逐渐适应不同培养基。培养过程中，细胞对葡萄糖的消耗速率是所有营养物质中最高的，需确保葡萄糖在培养过程中处于相对稳定的浓度而不被快速耗竭[6]。以葡萄糖为关键控制参数，通过离线计数、测定培养液上清中的葡萄糖浓度，间歇补加葡萄糖。培养结束将培养上清离心，测定蛋白表达情况，来对这些培养基进一步的筛选，优化培养工艺，从而建立起基于葡萄糖的动态流加培养过程，选出最为合适的培养基，对进一步的放大生产进行指导。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 细胞株 CHODG4423G10中国仓鼠卵巢细胞 (Chinese hamster ovary,CHO)，表达人肿瘤坏死因子的人源化单克隆抗体，由凯惠睿智生物科技（上海）有限公司提供，前期筛选在CD FortiCHOTM Medium中。
1．1．2 培养基 无血清培养基CD FortiCHOTM Medium购自Gibco公司；无血清培养基HyCell CHO TMMedium购自Hyclone公司；无血清培养基CHO CD07Medium购自上海奥浦迈生物科技有限公司；无血清培养基CellventoTM CHO 210Medium购自Millipore公司；无血清培养基CHO CD022Medium购自甘肃健顺生物科技有限公司公司。
1．1．2 仪器与耗材 二氧化碳振荡培养箱（Kuhner/ ISF1XC）；生物安全柜（Thermo/1300 SERIES A2）；countstar细胞自动计数仪(COUNT STAT)；离心机(Eppendorf/5810R)；乳酸葡萄糖双功能分析仪（山东省科学院生物研究所/ SBA40C）；振荡培养瓶（corning/125 mL/250 mL）；BioRad 15mL重力层析柱（BioRad/#7321010）；层析介质MabSelect SuRe（GE#17543803）；NanoDrop 2000超微量分光光度计（Thermo）；倒置显微镜（NIKON公司）；0.22 um 微量过滤器（Millipore）；Dionex U3000高效液相色谱仪（DIONEX）；蛋白A亲和层析柱（Life Technologies/2.1mmD*30 mmH,104ul）。
1．1．2 实验试剂 Lglutamine 购自Gibco公司；培养基补料CD Efficient Feed AGTTM购自Gibco公司；培养基补料Cell Boost 5TM购自Hyclone公司；培养基补料CDF06V5购自上海奥浦迈生物科技有限公司；培养基补料CellventoTM Feed 210购自Millipore公司；Buffer A：20 mM PB(PH7.0)，Buffer B：20 mM 柠檬酸缓冲溶液(PH3.5)，Buffer C：1.0 M TrisHCl缓冲溶液(PH8.5)，以上三种缓冲溶液均由由凯惠睿智生物科技（上海）有限公司纯化组提供；台盼蓝购自Sigma公司；葡萄糖购自国药集团化学试剂有限公司；20*PBS(中久科技有限公司)；GlyHCL（上海凌峰化学试剂有限公司）。
1．2 方法
1．2．1 试验方法
1．2．1 .1 细胞复苏 从液氮罐中取出冻存的细胞置于干冰中，遵循“慢冻速溶”原则。于37℃水浴槽中快速融化。低速离心后吸出上清液，使用新鲜的相应培养基（CD FortiCHOTM）进行细胞重悬，以35x105 Cell/mL的密度，接种30 mL于125 mL的振荡培养瓶中进行培养，二氧化碳振荡培养箱条件为温度37℃，转速130 rpm，CO2浓度8%。
复苏接种后每天取样进行细胞计数，显微镜下观察细胞形态，确定有无微生物污染，当密度达到35x106 Cell/mL时，以35x105 Cell/mL的接种密度进行传代，维持细胞活率大于95%。 至少传代23次，细胞倍增时间稳定，才可进行下步实验。
1．2．1 .2 细胞株驯化 将稳定生长于CD FortiCHOTM培养基的细胞进行扩大培养至所需量。按照50%、100%的比例逐步驯化到适应目的培养基HyCell CHO TMMedium、CHO CD07Medium、CellventoTM CHO 210Medium、CHO CD022Medium[7]。
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