组蛋白去乙酰化酶对单核来源树突状细胞功能的调控作用
组蛋白去乙酰化酶对单核来源树突状细胞功能的调控作用[20200507184404]
摘要：本研究利用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和白介素4（IL-4）体外诱导C57BL/6小鼠骨髓中的单核细胞分化成单核来源树突状细胞（moDCs），通过检测moDCs中组蛋白去乙酰化酶（HDAC）家族的mRNA水平，筛选出表达较高的两种HDAC基因，然后运用诱导性敲除和DC特异性敲除两种方法构建基因条件性敲除小鼠模型，体外培养并分选出moDCs，再用脂多糖（LPS）刺激24h后用ELISA检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）分泌水平。结果表明HDAC1、HDAC2在moDCs中相对高表达，运用两种不同方法同时敲除HDAC1和HDAC2后，moDCs的TNF-α分泌水平降低而IL-6分泌水平升高，说明HDAC1和HDAC2对moDCs的炎症因子分泌功能可能存在调控作用。
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关键字:组蛋白去乙酰化酶；单核来源树突状细胞；肿瘤坏死因子α；白介素6
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验动物 2
1.2 主要试剂 2
1.2.1细胞培养及样品制备相关试剂 2
1.2.2 流式细胞术相关试剂 2
1.2.3 RNA提取及实时定量PCR相关试剂2
1.2.4 ELISA相关试剂2
1.2.5 主要溶液配方3
1.3 主要仪器设备 3
1.4 实验方法3
1.4.1筛选moDCs中相对高表达的HDAC家族成员3
1.4.2 基因条件性敲除小鼠模型的构建6
1.4.3 诱导性敲除实验组moDCs的体外培养及分选6
1.4.4 DC特异性敲除实验组moDCs的体外培养及分选7
1.4.5 moDCs的刺激性培养7
1.4.6 ELISA检测7
1.5 数据处理7
2 结果与分析7
2.1 HDAC家族在moDCs与脾脏CD8+cDCs和CD8-cDCs中的表达8
2.2诱导性敲除HDAC对moDCs的影响8
2.2.1诱导性敲除HDAC对moDCs分化的影响8
2.2.2诱导性敲除HDAC对moDCs的 TNF-α分泌水平的影响8
2.2.3 诱导性敲除HDAC对moDCs的 IL-6分泌水平的影响9
2.3 DC特异性敲除HDAC对moDCs的影响9
2.3.1 DC特异性敲除HDAC对moDCs分化的影响9
2.3.2 DC特异性敲除 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
HDAC对moDCs的 TNF-α分泌水平的影响10
2.3.3 DC特异性敲除HDAC对moDCs的 IL-6分泌水平的影响10
3 讨论 11
3.1 HDAC家族在moDCs 中的表达11
3.2 HDAC1和HDAC2对moDCs功能的调控作用11
致谢12
参考文献12
组蛋白去乙酰化酶对单核来源树突状细胞功能的调控作用
引言
树突状细胞（DCs）是免疫系统中的专职抗原提呈细胞[1]，被认为是维系固有免疫和适应性免疫的关键媒介[2-3]。在炎症反应过程中，一类由单核细胞分化而来的DCs可被迅速募集到感染部位并提呈抗原给CD4+T细胞和CD8+T细胞，这类DC被称为moDCs。在感染情况下moDCs能够分泌大量的TNF-α和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)，从而抵抗病原感染[4-5]。组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)可使组蛋白去乙酰化，使染色质处于致密状态从而抑制基因的转录。HDAC家族可划分为四类：I类(HDAC1、2、3、8)、IIa类(HDAC4、5、7、9)、IIb类(HDAC6、10)和IV类(HDAC11)[6]。已有报道，HDAC6、9和Sirtuin1敲除后Foxp3+ Treg抑制炎症和自身免疫的功能得到促进[7-9]，单独敲除HDAC1后T细胞对于炎症的反应增强，Th2细胞IL-4分泌增加[10]，HDAC1和HDAC 2同时敲除后B细胞发育停滞在早期阶段并发生凋亡[11]，T细胞发育受阻[12]，HDAC7基因缺失导致胸腺中CD4+CD8+T细胞寿命严重缩短[13]。对于树突状细胞，目前仅有利用HDAC抑制剂对DC功能起负调控的作用的报道[14]。因而HDAC对于DC发育和功能的作用机制仍有待探究。本实验拟通过检测moDCs中相对高表达的HDAC基因，运用条件性敲除小鼠模型研究HDAC对moDCs功能的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物
C57BL/6小鼠，HDAC1flox/flox（简称HDAC1f/f）小鼠 [11]，HDAC2flox/flox（简称HDAC2f/f）小鼠[15]，CD11c-Cre-GFP小鼠 (The Jackson Laboratory，stock number:007567)，Rosa CreERT2小鼠(The Jackson Laboratory，stock number:008463)，6-14周龄，SPF级。小鼠饲养繁育在清华大学实验动物平台，保持12小时昼夜交替节律，并给予标准饮食。
1.2 主要试剂
1.2.1 细胞培养及样品制备相关试剂
红细胞裂解液RCRB (0.168M NH4Cl，实验室配制)；RPMI1640培养基 (Gibco)；胎牛血清FBS (Invitrogen)；胶原蛋白酶Collagenase III 10mg/ml (Worthington)；DNA消化酶DNase I 1mg/ml (Sigma);细胞培养用青霉素-链霉素 Penicillin-Streptomycin (Hyclone)；2-Mercaptoethanol (Gibco)；Recombinant Murine GM-CSF (Pe *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
proTech)；Recombinant Murine IL-4 (PeproTech)；LPS (Sigma)；4-OH Tamoxifen (Sigma)；3%FBS-EDTA-BSS（实验室配制）；3%FBS-KDS-BSS（实验室配制）；0.099M EDTA（实验室配制）；密度梯度介质溶液Nycodenz (Sigma，实验室配制成ρ=1.077g/ml)；DC阴性选择spleen cocktail antibody (pDC+cDC，实验室配制)；Magnetic Beads-Goat anti-Rat IgG (Biomag，BM560)。
1.2.2 流式细胞术相关试剂
流式抗体及染料：CD8单色偶联抗体（CD8-APC，CD8-PEcy7，CD8-PE，CD8-FITC），MHC-II-APC，CD11c-PEcy7，CD11b-PE，CD172a-FITC，CD45RA-PE，7-AAD Viability Staining Solution (eBioscience）。
1.2.3 RNA提取及实时定量PCR相关试剂
TRIzol RNA分离试剂 (Life Technologies）；三氯甲烷（北京现代东方精细化学品有限公司）；异丙醇（北京化工厂）；乙醇（北京化工厂）；DEPC水（碧云天）；定量 PCR试剂盒 (TaKaRa）；反转录试剂盒：PrimeScript RT reagent Kit (TaKaRa）；定量PCR引物由生工生物工程有限公司合成。
1.2.4 ELISA相关试剂
10× Coating Buffer (eBioscience）
(7) 用六孔板培养细胞，2ml 细胞悬液（即4×106个细胞）/孔，GM-CSF 20ng/ml，IL-4 100ng/ml，每个基因型培养9个孔37℃，5% CO2培养。
(8) 3天后按每孔2ml 1640完全培养基（含GM-CSF 20ng/ml，IL-4 100ng/ml）补液。
摘要：本研究利用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和白介素4（IL-4）体外诱导C57BL/6小鼠骨髓中的单核细胞分化成单核来源树突状细胞（moDCs），通过检测moDCs中组蛋白去乙酰化酶（HDAC）家族的mRNA水平，筛选出表达较高的两种HDAC基因，然后运用诱导性敲除和DC特异性敲除两种方法构建基因条件性敲除小鼠模型，体外培养并分选出moDCs，再用脂多糖（LPS）刺激24h后用ELISA检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）分泌水平。结果表明HDAC1、HDAC2在moDCs中相对高表达，运用两种不同方法同时敲除HDAC1和HDAC2后，moDCs的TNF-α分泌水平降低而IL-6分泌水平升高，说明HDAC1和HDAC2对moDCs的炎症因子分泌功能可能存在调控作用。
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关键字:组蛋白去乙酰化酶；单核来源树突状细胞；肿瘤坏死因子α；白介素6
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关键词1
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Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验动物 2
1.2 主要试剂 2
1.2.1细胞培养及样品制备相关试剂 2
1.2.2 流式细胞术相关试剂 2
1.2.3 RNA提取及实时定量PCR相关试剂2
1.2.4 ELISA相关试剂2
1.2.5 主要溶液配方3
1.3 主要仪器设备 3
1.4 实验方法3
1.4.1筛选moDCs中相对高表达的HDAC家族成员3
1.4.2 基因条件性敲除小鼠模型的构建6
1.4.3 诱导性敲除实验组moDCs的体外培养及分选6
1.4.4 DC特异性敲除实验组moDCs的体外培养及分选7
1.4.5 moDCs的刺激性培养7
1.4.6 ELISA检测7
1.5 数据处理7
2 结果与分析7
2.1 HDAC家族在moDCs与脾脏CD8+cDCs和CD8-cDCs中的表达8
2.2诱导性敲除HDAC对moDCs的影响8
2.2.1诱导性敲除HDAC对moDCs分化的影响8
2.2.2诱导性敲除HDAC对moDCs的 TNF-α分泌水平的影响8
2.2.3 诱导性敲除HDAC对moDCs的 IL-6分泌水平的影响9
2.3 DC特异性敲除HDAC对moDCs的影响9
2.3.1 DC特异性敲除HDAC对moDCs分化的影响9
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HDAC对moDCs的 TNF-α分泌水平的影响10
2.3.3 DC特异性敲除HDAC对moDCs的 IL-6分泌水平的影响10
3 讨论 11
3.1 HDAC家族在moDCs 中的表达11
3.2 HDAC1和HDAC2对moDCs功能的调控作用11
致谢12
参考文献12
组蛋白去乙酰化酶对单核来源树突状细胞功能的调控作用
引言
树突状细胞（DCs）是免疫系统中的专职抗原提呈细胞[1]，被认为是维系固有免疫和适应性免疫的关键媒介[2-3]。在炎症反应过程中，一类由单核细胞分化而来的DCs可被迅速募集到感染部位并提呈抗原给CD4+T细胞和CD8+T细胞，这类DC被称为moDCs。在感染情况下moDCs能够分泌大量的TNF-α和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)，从而抵抗病原感染[4-5]。组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)可使组蛋白去乙酰化，使染色质处于致密状态从而抑制基因的转录。HDAC家族可划分为四类：I类(HDAC1、2、3、8)、IIa类(HDAC4、5、7、9)、IIb类(HDAC6、10)和IV类(HDAC11)[6]。已有报道，HDAC6、9和Sirtuin1敲除后Foxp3+ Treg抑制炎症和自身免疫的功能得到促进[7-9]，单独敲除HDAC1后T细胞对于炎症的反应增强，Th2细胞IL-4分泌增加[10]，HDAC1和HDAC 2同时敲除后B细胞发育停滞在早期阶段并发生凋亡[11]，T细胞发育受阻[12]，HDAC7基因缺失导致胸腺中CD4+CD8+T细胞寿命严重缩短[13]。对于树突状细胞，目前仅有利用HDAC抑制剂对DC功能起负调控的作用的报道[14]。因而HDAC对于DC发育和功能的作用机制仍有待探究。本实验拟通过检测moDCs中相对高表达的HDAC基因，运用条件性敲除小鼠模型研究HDAC对moDCs功能的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物
C57BL/6小鼠，HDAC1flox/flox（简称HDAC1f/f）小鼠 [11]，HDAC2flox/flox（简称HDAC2f/f）小鼠[15]，CD11c-Cre-GFP小鼠 (The Jackson Laboratory，stock number:007567)，Rosa CreERT2小鼠(The Jackson Laboratory，stock number:008463)，6-14周龄，SPF级。小鼠饲养繁育在清华大学实验动物平台，保持12小时昼夜交替节律，并给予标准饮食。
1.2 主要试剂
1.2.1 细胞培养及样品制备相关试剂
红细胞裂解液RCRB (0.168M NH4Cl，实验室配制)；RPMI1640培养基 (Gibco)；胎牛血清FBS (Invitrogen)；胶原蛋白酶Collagenase III 10mg/ml (Worthington)；DNA消化酶DNase I 1mg/ml (Sigma);细胞培养用青霉素-链霉素 Penicillin-Streptomycin (Hyclone)；2-Mercaptoethanol (Gibco)；Recombinant Murine GM-CSF (Pe *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
proTech)；Recombinant Murine IL-4 (PeproTech)；LPS (Sigma)；4-OH Tamoxifen (Sigma)；3%FBS-EDTA-BSS（实验室配制）；3%FBS-KDS-BSS（实验室配制）；0.099M EDTA（实验室配制）；密度梯度介质溶液Nycodenz (Sigma，实验室配制成ρ=1.077g/ml)；DC阴性选择spleen cocktail antibody (pDC+cDC，实验室配制)；Magnetic Beads-Goat anti-Rat IgG (Biomag，BM560)。
1.2.2 流式细胞术相关试剂
流式抗体及染料：CD8单色偶联抗体（CD8-APC，CD8-PEcy7，CD8-PE，CD8-FITC），MHC-II-APC，CD11c-PEcy7，CD11b-PE，CD172a-FITC，CD45RA-PE，7-AAD Viability Staining Solution (eBioscience）。
1.2.3 RNA提取及实时定量PCR相关试剂
TRIzol RNA分离试剂 (Life Technologies）；三氯甲烷（北京现代东方精细化学品有限公司）；异丙醇（北京化工厂）；乙醇（北京化工厂）；DEPC水（碧云天）；定量 PCR试剂盒 (TaKaRa）；反转录试剂盒：PrimeScript RT reagent Kit (TaKaRa）；定量PCR引物由生工生物工程有限公司合成。
1.2.4 ELISA相关试剂
10× Coating Buffer (eBioscience）
(7) 用六孔板培养细胞，2ml 细胞悬液（即4×106个细胞）/孔，GM-CSF 20ng/ml，IL-4 100ng/ml，每个基因型培养9个孔37℃，5% CO2培养。
(8) 3天后按每孔2ml 1640完全培养基（含GM-CSF 20ng/ml，IL-4 100ng/ml）补液。
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