猪肠道粘膜乳酸菌分离鉴定以及益生性和抗逆性的初步研究
猪肠道粘膜乳酸菌分离鉴定以及益生性和抗逆性的初步研究[20200510204205]
摘要：本试验旨在分离筛选猪肠道粘膜中具有较高酸化能力的乳酸菌菌株，并对其益生和抗逆性进行研究。采用常规分离手段，从猪粘膜上分离获得22株乳酸菌。通过耐酸实验，从22株菌中筛选出7株酸化能力强的乳酸菌菌株；在此基础上，进行了乳酸菌的抑菌和抗逆性试验。结果显示，L26和L23菌株较其他五株菌对pH2.5的耐受能力更强；模拟研究胃环境对乳酸菌存活力影响上，菌株L23、L26在培养3小时后仍有较高的存活率，表现出对胃环境有较强的耐受性；7株乳酸菌对指示菌K88、K99、鸡白痢三种指示菌均有不同程度的抑制作用，其中L26菌株上清液对各指示菌的有广谱抑菌效果；在对温度的耐受上，上述7株乳酸菌菌株对60℃及以上温度普遍敏感，40℃时7株乳酸菌菌株有不同情况的生长。实验结果说明，猪肠道中的部分乳酸菌具有益生性以及抗逆性，具有作为益生素的潜力。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
关键字:乳酸菌；分离；益生作用；抗逆性
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2 方法2
1.2.1分离纯化乳酸菌2
1.2.2革兰氏染色2
1.2.3属的鉴定2
1.2.4 酸化实验2
1.2.5菌株生长曲线测定3
1.2.6抑制肠道有害菌试验3
1.2.7耐酸试验3
1.2.8耐胆盐试验3
1.2.9耐人工胃胰液能力测定4
1.2.10耐热试验4
2实验结果4
2.1实验分离所得菌株的菌落形态观察4
2.2分离所得乳酸菌的初步筛选4
2.3测定筛选出的菌株的产酸特性5
2.4筛选出的7株菌株的生长特性测定5
2.5 实验菌株抑菌实验结果6
2.6实验菌株耐酸实验结6
2.7实验菌株耐胆盐实验结果6
2.8实验菌株耐人工胃胰液能力测定6
2.9实验菌株耐热实验结果7
3讨论 7
3.1抑菌实验7
3.2耐酸实验8
3.3耐胆盐实验8
3.4耐人工耐人工胃胰液能力测定8
3.5耐热实验9
4讨论9
致谢9
参考文献9
猪肠道粘膜乳酸菌的分离鉴定以及益生性和抗逆性的初步研究
引言
随着国际上禁用饲用抗生素的呼声俞来俞高，饲料中禁用饲用抗生素已是大势所趋，饲用抗生素替代品的开发也 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
由此成为当前一个研究热点。在畜牧生产中，益生素已广泛用于动物生产，但其应用效果并不十分理想，其中一个重要原因是益生素菌株在动物肠道内的存活问题。目前，生产上应用的绝大多数益生素菌株来自土壤、水等环境，由于外源益生素菌株的生长环境与动物体内环境相差甚远，因而目前许多学者认为理想的益生素菌株最好来自于动物自身胃肠道，并且提出在菌株筛选中要考虑菌株的生长速度、能耐受动物自身的胃肠道环境因素如胃肠道胆盐、酸性环境、胃蛋白酶等。本研究为获得具有较好益生功能的乳酸菌株，实验以猪粘膜为菌源，分离了猪结肠粘膜上的乳酸菌群，并对其益生性以及抗逆性进行了初步研究分析。
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1 14、28日龄左右的大白和梅山黑猪仔猪。分别在太仓梅山黑猪种猪场、上海农场安丰养猪场饲养。
1.1.2仪器和设备
ZHWY--2102型全温振荡培养箱、H6000型生物显微镜、HZQ--C型双层空气恒温振荡器、pH213型酸度计、101A一2型电热鼓风干燥箱、UV--4802型紫外可见光光度计、YMQ--L31--400型立式压力蒸汽灭菌锅、JJT一1300型洁净工作台、MDF-382E日本三洋超低温冰箱、发酵罐。
1.1.3培养基与试剂
MRS培养基：蛋白胨l0g、牛肉膏10g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、柠檬酸二铵2g、K2HP04 2g，吐温(Tween)一80 1．0ml、MgS047H20 0．5g、MnS044H20 0．2g、蒸馏水1000ml、pH为6.5、121℃灭菌20min。
试剂：吲哚试剂、硝酸盐还原试剂、双氧水、L．精氨酸液、奈氏试剂、革兰氏染色液和孔雀绿染色液。
1．2方法
1.2.1菌株的分离纯化
无菌采集14日龄和28日龄健康仔猪肠道粘膜（冻存于-20℃条件下或者整肠带回）。取新鲜粘膜0.5 g于4.5 mL灭菌生理盐水中,摇匀。进行梯度稀释,稀释至第7个梯度,吸取10-5、10-6、10-7梯度稀释液100μL于固体MRS(pH5.5-6.2)培养基平板上均匀涂布。每个平板两个平行，将上述平板置于37℃恒温培养箱培养48h。在每个MRS固体培养基培养板上挑取5个左右、活性高、不同菌落形态的菌株, 进行MRS平板划线纯化,连续纯化2-3次到获得纯菌株为止。
1.2.2 革兰氏染色：取干净载玻片，用接种环取一环无菌生理盐水于玻片，挑取少量细菌，在玻片上涂匀，干燥、固定，再染色镜检(16X100)。
1.2.3 属的鉴定：包括氧化氢酶试验、哨酸盐还原试验、明胶液化试验、吲哚试验、硫化氢试验，如上述实验结果均为阴性，结合革兰氏染色结果，则可初步定为乳酸杆菌属。革兰氏阳性兼性厌氧球菌：根据细胞形态学、从葡萄糖产酸产气、10℃、45℃生长试验，pH9.6生长试验，4%NaCI、6.5%NaCI生长试验，细胞运动性(半固体穿刺)试验,做初步鉴别。
1.2.4 产酸试验：
在测定乳酸的产生速度方面，以100 ul的乳酸菌菌株的预先培养物，随后接种到10毫升改良肉汤中，并包含0.01克/升的溴酚蓝指示剂。改良MRS肉汤包括标准肉汤(pH值6.3)但没有没有醋酸钠和葡萄糖，但含有35 g / L麦芽糖和5 g / L果糖。培养是覆盖着 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
1毫升石蜡排除氧气在30度培养，在4 d内观察培养物的颜色变化，颜色变化的时间即溴苯酚酸碱指示剂变色时间。在接种后90 h测定培养物的pH值。为测定最大产酸量，取100 ul 升的液体培养基接种在10毫升改良肉汤，在30度条件下厌氧培养48小时。用试剂盒测定乳酸。根据结果，初次筛选产酸性能强的菌株。乳酸的浓度和乙酸在培养物上清是由高效液相色谱分析。
1.2.5菌株的生长曲线测定
MRS液体培养基中分别接种7株试验菌株菌液，37℃静置培养15～18 h使菌种活化。将活化的菌种以5％(WV)的接种量接入MRS液体培养基，混合均匀后，取少量作为0 h的样，于600 nm比色，测定培养液的0D值，以未接种的培养基作为空白对照调零。各菌在37℃条件下厌氧培养，在一定时间点取样测定OD600值，以未接种的培养基作为空白对照调零。
1.2.6 抑菌性实验室
供试菌在 MRS 液体培养基中 37℃厌氧培养 2 代（菌液中菌的浓度为 3×108CFU/mL），将活化好的菌株离心（10000g，4℃，10min），上清液经 0.22μm 微孔滤膜过滤收集备用。将指示菌分别于 LB 培养基和 MRS 液体培养基中 37℃培养 24h 。然后，离心（10000g，4℃，10min），弃上清液，菌体悬浮于灭菌生理盐水中，再离心洗涤 1 次，最后制成浓度3.0 ×108CFU/mL 的菌悬液，备用。抑菌能力的测定：采用改进的HECHARD的琼脂平板扩散法。将含菌数为 3.0 ×108CFU/mL 的200μL 指示菌悬液分别接种到适宜的琼脂培养基上，无菌条件下放置2h。待琼脂板凝固后用直径为8mm的牛津杯在琼脂培养基上打孔。为排除有机酸的干扰，供试菌上清液应经微孔滤膜过滤后份两组，一组不调pH，一组用1mol/L的NaOH调pH为6.5。分别取处理过的上清液100μL加入到琼脂板上的孔中，室温扩展 3-5h，37℃培养48h。测量抑菌圈的直径，并设重复，取抑菌圈直径的平均值。
1.2.7 耐胆盐试验
摘要：本试验旨在分离筛选猪肠道粘膜中具有较高酸化能力的乳酸菌菌株，并对其益生和抗逆性进行研究。采用常规分离手段，从猪粘膜上分离获得22株乳酸菌。通过耐酸实验，从22株菌中筛选出7株酸化能力强的乳酸菌菌株；在此基础上，进行了乳酸菌的抑菌和抗逆性试验。结果显示，L26和L23菌株较其他五株菌对pH2.5的耐受能力更强；模拟研究胃环境对乳酸菌存活力影响上，菌株L23、L26在培养3小时后仍有较高的存活率，表现出对胃环境有较强的耐受性；7株乳酸菌对指示菌K88、K99、鸡白痢三种指示菌均有不同程度的抑制作用，其中L26菌株上清液对各指示菌的有广谱抑菌效果；在对温度的耐受上，上述7株乳酸菌菌株对60℃及以上温度普遍敏感，40℃时7株乳酸菌菌株有不同情况的生长。实验结果说明，猪肠道中的部分乳酸菌具有益生性以及抗逆性，具有作为益生素的潜力。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
关键字:乳酸菌；分离；益生作用；抗逆性
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2 方法2
1.2.1分离纯化乳酸菌2
1.2.2革兰氏染色2
1.2.3属的鉴定2
1.2.4 酸化实验2
1.2.5菌株生长曲线测定3
1.2.6抑制肠道有害菌试验3
1.2.7耐酸试验3
1.2.8耐胆盐试验3
1.2.9耐人工胃胰液能力测定4
1.2.10耐热试验4
2实验结果4
2.1实验分离所得菌株的菌落形态观察4
2.2分离所得乳酸菌的初步筛选4
2.3测定筛选出的菌株的产酸特性5
2.4筛选出的7株菌株的生长特性测定5
2.5 实验菌株抑菌实验结果6
2.6实验菌株耐酸实验结6
2.7实验菌株耐胆盐实验结果6
2.8实验菌株耐人工胃胰液能力测定6
2.9实验菌株耐热实验结果7
3讨论 7
3.1抑菌实验7
3.2耐酸实验8
3.3耐胆盐实验8
3.4耐人工耐人工胃胰液能力测定8
3.5耐热实验9
4讨论9
致谢9
参考文献9
猪肠道粘膜乳酸菌的分离鉴定以及益生性和抗逆性的初步研究
引言
随着国际上禁用饲用抗生素的呼声俞来俞高，饲料中禁用饲用抗生素已是大势所趋，饲用抗生素替代品的开发也 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
由此成为当前一个研究热点。在畜牧生产中，益生素已广泛用于动物生产，但其应用效果并不十分理想，其中一个重要原因是益生素菌株在动物肠道内的存活问题。目前，生产上应用的绝大多数益生素菌株来自土壤、水等环境，由于外源益生素菌株的生长环境与动物体内环境相差甚远，因而目前许多学者认为理想的益生素菌株最好来自于动物自身胃肠道，并且提出在菌株筛选中要考虑菌株的生长速度、能耐受动物自身的胃肠道环境因素如胃肠道胆盐、酸性环境、胃蛋白酶等。本研究为获得具有较好益生功能的乳酸菌株，实验以猪粘膜为菌源，分离了猪结肠粘膜上的乳酸菌群，并对其益生性以及抗逆性进行了初步研究分析。
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1 14、28日龄左右的大白和梅山黑猪仔猪。分别在太仓梅山黑猪种猪场、上海农场安丰养猪场饲养。
1.1.2仪器和设备
ZHWY--2102型全温振荡培养箱、H6000型生物显微镜、HZQ--C型双层空气恒温振荡器、pH213型酸度计、101A一2型电热鼓风干燥箱、UV--4802型紫外可见光光度计、YMQ--L31--400型立式压力蒸汽灭菌锅、JJT一1300型洁净工作台、MDF-382E日本三洋超低温冰箱、发酵罐。
1.1.3培养基与试剂
MRS培养基：蛋白胨l0g、牛肉膏10g、酵母提取物5g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、柠檬酸二铵2g、K2HP04 2g，吐温(Tween)一80 1．0ml、MgS047H20 0．5g、MnS044H20 0．2g、蒸馏水1000ml、pH为6.5、121℃灭菌20min。
试剂：吲哚试剂、硝酸盐还原试剂、双氧水、L．精氨酸液、奈氏试剂、革兰氏染色液和孔雀绿染色液。
1．2方法
1.2.1菌株的分离纯化
无菌采集14日龄和28日龄健康仔猪肠道粘膜（冻存于-20℃条件下或者整肠带回）。取新鲜粘膜0.5 g于4.5 mL灭菌生理盐水中,摇匀。进行梯度稀释,稀释至第7个梯度,吸取10-5、10-6、10-7梯度稀释液100μL于固体MRS(pH5.5-6.2)培养基平板上均匀涂布。每个平板两个平行，将上述平板置于37℃恒温培养箱培养48h。在每个MRS固体培养基培养板上挑取5个左右、活性高、不同菌落形态的菌株, 进行MRS平板划线纯化,连续纯化2-3次到获得纯菌株为止。
1.2.2 革兰氏染色：取干净载玻片，用接种环取一环无菌生理盐水于玻片，挑取少量细菌，在玻片上涂匀，干燥、固定，再染色镜检(16X100)。
1.2.3 属的鉴定：包括氧化氢酶试验、哨酸盐还原试验、明胶液化试验、吲哚试验、硫化氢试验，如上述实验结果均为阴性，结合革兰氏染色结果，则可初步定为乳酸杆菌属。革兰氏阳性兼性厌氧球菌：根据细胞形态学、从葡萄糖产酸产气、10℃、45℃生长试验，pH9.6生长试验，4%NaCI、6.5%NaCI生长试验，细胞运动性(半固体穿刺)试验,做初步鉴别。
1.2.4 产酸试验：
在测定乳酸的产生速度方面，以100 ul的乳酸菌菌株的预先培养物，随后接种到10毫升改良肉汤中，并包含0.01克/升的溴酚蓝指示剂。改良MRS肉汤包括标准肉汤(pH值6.3)但没有没有醋酸钠和葡萄糖，但含有35 g / L麦芽糖和5 g / L果糖。培养是覆盖着 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
1毫升石蜡排除氧气在30度培养，在4 d内观察培养物的颜色变化，颜色变化的时间即溴苯酚酸碱指示剂变色时间。在接种后90 h测定培养物的pH值。为测定最大产酸量，取100 ul 升的液体培养基接种在10毫升改良肉汤，在30度条件下厌氧培养48小时。用试剂盒测定乳酸。根据结果，初次筛选产酸性能强的菌株。乳酸的浓度和乙酸在培养物上清是由高效液相色谱分析。
1.2.5菌株的生长曲线测定
MRS液体培养基中分别接种7株试验菌株菌液，37℃静置培养15～18 h使菌种活化。将活化的菌种以5％(WV)的接种量接入MRS液体培养基，混合均匀后，取少量作为0 h的样，于600 nm比色，测定培养液的0D值，以未接种的培养基作为空白对照调零。各菌在37℃条件下厌氧培养，在一定时间点取样测定OD600值，以未接种的培养基作为空白对照调零。
1.2.6 抑菌性实验室
供试菌在 MRS 液体培养基中 37℃厌氧培养 2 代（菌液中菌的浓度为 3×108CFU/mL），将活化好的菌株离心（10000g，4℃，10min），上清液经 0.22μm 微孔滤膜过滤收集备用。将指示菌分别于 LB 培养基和 MRS 液体培养基中 37℃培养 24h 。然后，离心（10000g，4℃，10min），弃上清液，菌体悬浮于灭菌生理盐水中，再离心洗涤 1 次，最后制成浓度3.0 ×108CFU/mL 的菌悬液，备用。抑菌能力的测定：采用改进的HECHARD的琼脂平板扩散法。将含菌数为 3.0 ×108CFU/mL 的200μL 指示菌悬液分别接种到适宜的琼脂培养基上，无菌条件下放置2h。待琼脂板凝固后用直径为8mm的牛津杯在琼脂培养基上打孔。为排除有机酸的干扰，供试菌上清液应经微孔滤膜过滤后份两组，一组不调pH，一组用1mol/L的NaOH调pH为6.5。分别取处理过的上清液100μL加入到琼脂板上的孔中，室温扩展 3-5h，37℃培养48h。测量抑菌圈的直径，并设重复，取抑菌圈直径的平均值。
1.2.7 耐胆盐试验
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