猪bmp4基因3utr调控区多态性分析
摘 要 1摘 要BMP4是骨形态发生蛋白家族的重要成员之一，在哺乳动物雌性生殖中发挥重要作用。本文以BMP4基因作为候选基因，利用PCR扩增和池DNA测序技术获得BMP4基因3UTR区序列和SNPs，采用AS-PCR技术分析苏淮猪和梅山猪SNPs位点多态性。结果表明苏淮猪BMP4基因3UTR区序列长度为281bp，含有一个(AC) 9微卫星位点；在苏淮猪BMP4基因3UTR区20nt处发现一个SNP，AS-PCR检测到3种基因型（GG、GC和CC）；在苏淮猪中，GG型和G等位基因为优势基因型和优势等位基因，频率分别为为0.815和0.887，而在高繁殖力猪种梅山猪中CC型和C等位基因为优势基因型和优势等位基因，频率分别为为0.667和0.770。研究结果表明苏淮猪BMP4基因3UTR区20G>C位点多态性可能与繁殖性能有关。
目录
引言
骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)是转化生长因子β超家族中最大的一个亚家族[1]。BMP4是骨形态发生蛋白家族的重要成员之一，初称BMP2B，后由于BMPs家族成员不断扩大，按发现先后顺序改称为BMP4。近年来研究发现，BMP4是胚胎早期肺发育的关键生长因子之一，研究发现在培养基中加入BMP4可显著刺激小鼠胚胎肺分支的形成，对小鼠早期胚胎肺脏的生长与成熟起正向调节作用[7]。同时在维持小鼠胚胎干细胞的多能性具有关键作用,对胚胎干细胞神经分化进行负调控[8]。在哺乳动物生殖活动中，BMP4作用比较广泛，研究表明BMP4在睾丸和附睾中大量表达，BMP4突变杂合体表现为生殖细胞恶化、精子数量减少、精子活性降低[2]。在雌性哺乳动物中，BMP4基因在卵泡发育过程中发挥着重要的调节作用[3]，是卵泡生长发育过程中的必要促进因子[4]。随着进一步深入的研究，结果发现BMP4在卵巢组织内通过局部的信号传导系统实现对卵泡的生长、发育、存活以及雌孕激素分泌的调节。现已确定在哺乳动物卵巢内，有多个BMPs的成员的存在，且不同的成员在卵巢中的分布有差异，并在卵泡发生的不同阶段发挥着作用不同，其中BMP4可激活Smad信号通路后促进小鼠原始卵泡向初级卵泡转变，并抑制卵母细胞的调亡[56]。
苏淮猪（新淮猪瘦肉型母本新品系）是以抗逆性强的新淮猪为杂交母本，生长速度 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
快的大约克猪种为杂交父本，于1998年开始培育的新型猪种[9]，具有抗逆性与适应性强、生长速度快、母猪温顺、好饲养、发情明显的特点。2011年 “苏淮猪”正式获得国家畜禽新品种证书，成为江苏省第二个通过国家畜禽遗传资源委员会审定的猪新品种，并成功入选2012年农业部主导品种和主推技术，但目前关于苏淮猪的研究较少。本研究以苏淮猪为实验材料，采用PCR方法扩增和测序获得苏淮猪BMP4基因3UTR序列，利用DNA池筛选BMP4基因3UTR多态位点，通过ASPCR（Allelespecific PCR）方法对BMP4基因3UTR进行单核苷酸多态性检测，旨在寻找与产仔数相关的遗传标记，为苏淮猪繁殖性能的标记辅助选择提供科学依据。
1 材料和方法
1.1 实验材料
选择健康无病、体况良好的苏淮猪119头和梅山猪63头，分别来自淮安市淮阴种猪场和国家小梅山猪育种中心。用耳号钳采集耳组织(约0.15 g )，20 ℃冻存。使用常规的酚氯仿抽提法提取猪基因组DNA，溶于双蒸水，20 ℃保存。
1.2 主要试剂和仪器
1.2.1试剂
Taq DNA聚合酶（TaKaRa Taq,TaKaRa premix LATaq）购自于上海皓嘉科技发展有限公司，DNA分子量marker、琼脂糖、DNA green核酸染料等购自南京鼎国生物技术有限公司。
1.2.2仪器
可调式微量移液器：Eppendorf公司
超低温冰箱：Thereto公司
梯度PCR仪：TaKaRa公司
高速冷冻离心机：Eppendorf公司
DYYIII2电泳仪：北京流体仪器厂
电泳凝胶成像仪：BioRad公司
微波炉：格兰仕
1.3 引物设计与PCR扩增
根据猪基因组序列（GenBank登录号：NC_010443.4），利用Primer5.0软件针对猪BMP4基因3UTR序列设计1对引物，命名为引物P1。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。引物信息见表1。
使用提取的苏淮猪基因组DNA（混合样品数>20）作为模板进行PCR扩增，反应总体积为10 μL：0.5 μL基因组DNA，5 μLPremix rTaq，上游引物，0.5 μL，下游引物，0.5 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性5min；35个循环（95 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30s）；最后72 ℃延伸7min；4 ℃保存产物。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，Tanon3500凝胶成像系统拍照。
1.4测序
将PCR 扩增产物交由苏州金唯智生物科技有限公司进行测序，序列用DNAman软件进行比对分析。
1.5 ASPCR扩增
针对苏淮猪BMP4基因3UTR突变位点，利用Primer5.0软件设计2条等位基因特异性正向引物和1条反向共用引物，分别命名为P2和P3，对苏淮猪及梅山猪个体进行分型。引物由上海英骏生物技术有限公司合成，引物信息见表1。
PCR反应条件为：98 ℃预变性30s；34个循环（98 ℃变性10 s，54 ℃/52℃退火30 s，72 ℃延伸30 s）；最后72 ℃延伸7min；4℃保存产物。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。10 μL的ASPCR扩增反应体系：
Premix LA Taq 5 μL
模板DNA 0.5 μL
引物F 0.5 μL
引物R 0.5 μL
ddH2O 3.5 μL
表1： 引物序列、退火温度及产物大小
引物名称
引物序列(5→3)
GenBank
登录号
退火温度(℃)
产物大小( bp)
P1
F: CCCCTTTCCACTGGCTGA
NC_010443.4
54
396
R: :GGCCAAAACATTTGCACAT
P2
F: AGGCCTTCCGTGGGTAC
54
188
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引言
骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)是转化生长因子β超家族中最大的一个亚家族[1]。BMP4是骨形态发生蛋白家族的重要成员之一，初称BMP2B，后由于BMPs家族成员不断扩大，按发现先后顺序改称为BMP4。近年来研究发现，BMP4是胚胎早期肺发育的关键生长因子之一，研究发现在培养基中加入BMP4可显著刺激小鼠胚胎肺分支的形成，对小鼠早期胚胎肺脏的生长与成熟起正向调节作用[7]。同时在维持小鼠胚胎干细胞的多能性具有关键作用,对胚胎干细胞神经分化进行负调控[8]。在哺乳动物生殖活动中，BMP4作用比较广泛，研究表明BMP4在睾丸和附睾中大量表达，BMP4突变杂合体表现为生殖细胞恶化、精子数量减少、精子活性降低[2]。在雌性哺乳动物中，BMP4基因在卵泡发育过程中发挥着重要的调节作用[3]，是卵泡生长发育过程中的必要促进因子[4]。随着进一步深入的研究，结果发现BMP4在卵巢组织内通过局部的信号传导系统实现对卵泡的生长、发育、存活以及雌孕激素分泌的调节。现已确定在哺乳动物卵巢内，有多个BMPs的成员的存在，且不同的成员在卵巢中的分布有差异，并在卵泡发生的不同阶段发挥着作用不同，其中BMP4可激活Smad信号通路后促进小鼠原始卵泡向初级卵泡转变，并抑制卵母细胞的调亡[56]。
苏淮猪（新淮猪瘦肉型母本新品系）是以抗逆性强的新淮猪为杂交母本，生长速度 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
快的大约克猪种为杂交父本，于1998年开始培育的新型猪种[9]，具有抗逆性与适应性强、生长速度快、母猪温顺、好饲养、发情明显的特点。2011年 “苏淮猪”正式获得国家畜禽新品种证书，成为江苏省第二个通过国家畜禽遗传资源委员会审定的猪新品种，并成功入选2012年农业部主导品种和主推技术，但目前关于苏淮猪的研究较少。本研究以苏淮猪为实验材料，采用PCR方法扩增和测序获得苏淮猪BMP4基因3UTR序列，利用DNA池筛选BMP4基因3UTR多态位点，通过ASPCR（Allelespecific PCR）方法对BMP4基因3UTR进行单核苷酸多态性检测，旨在寻找与产仔数相关的遗传标记，为苏淮猪繁殖性能的标记辅助选择提供科学依据。
1 材料和方法
1.1 实验材料
选择健康无病、体况良好的苏淮猪119头和梅山猪63头，分别来自淮安市淮阴种猪场和国家小梅山猪育种中心。用耳号钳采集耳组织(约0.15 g )，20 ℃冻存。使用常规的酚氯仿抽提法提取猪基因组DNA，溶于双蒸水，20 ℃保存。
1.2 主要试剂和仪器
1.2.1试剂
Taq DNA聚合酶（TaKaRa Taq,TaKaRa premix LATaq）购自于上海皓嘉科技发展有限公司，DNA分子量marker、琼脂糖、DNA green核酸染料等购自南京鼎国生物技术有限公司。
1.2.2仪器
可调式微量移液器：Eppendorf公司
超低温冰箱：Thereto公司
梯度PCR仪：TaKaRa公司
高速冷冻离心机：Eppendorf公司
DYYIII2电泳仪：北京流体仪器厂
电泳凝胶成像仪：BioRad公司
微波炉：格兰仕
1.3 引物设计与PCR扩增
根据猪基因组序列（GenBank登录号：NC_010443.4），利用Primer5.0软件针对猪BMP4基因3UTR序列设计1对引物，命名为引物P1。引物由上海英骏生物技术有限公司合成。引物信息见表1。
使用提取的苏淮猪基因组DNA（混合样品数>20）作为模板进行PCR扩增，反应总体积为10 μL：0.5 μL基因组DNA，5 μLPremix rTaq，上游引物，0.5 μL，下游引物，0.5 μL。PCR反应条件为：95 ℃预变性5min；35个循环（95 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30s）；最后72 ℃延伸7min；4 ℃保存产物。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，Tanon3500凝胶成像系统拍照。
1.4测序
将PCR 扩增产物交由苏州金唯智生物科技有限公司进行测序，序列用DNAman软件进行比对分析。
1.5 ASPCR扩增
针对苏淮猪BMP4基因3UTR突变位点，利用Primer5.0软件设计2条等位基因特异性正向引物和1条反向共用引物，分别命名为P2和P3，对苏淮猪及梅山猪个体进行分型。引物由上海英骏生物技术有限公司合成，引物信息见表1。
PCR反应条件为：98 ℃预变性30s；34个循环（98 ℃变性10 s，54 ℃/52℃退火30 s，72 ℃延伸30 s）；最后72 ℃延伸7min；4℃保存产物。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。10 μL的ASPCR扩增反应体系：
Premix LA Taq 5 μL
模板DNA 0.5 μL
引物F 0.5 μL
引物R 0.5 μL
ddH2O 3.5 μL
表1： 引物序列、退火温度及产物大小
引物名称
引物序列(5→3)
GenBank
登录号
退火温度(℃)
产物大小( bp)
P1
F: CCCCTTTCCACTGGCTGA
NC_010443.4
54
396
R: :GGCCAAAACATTTGCACAT
P2
F: AGGCCTTCCGTGGGTAC
54
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