猪支气管败血波氏杆菌的分离与鉴定
猪支气管败血波氏杆菌的分离与鉴定[20200507185824]
摘要：本研究从山东某猪场送检的患呼吸道综合症仔猪的肺脏病料中分离获得1株细菌，经形态学观察、生化试验和小鼠致病性试验进行鉴定，结果证明，该分离菌为猪支气管败血波氏杆菌，1.09×104个活菌腹腔注射，对小鼠有致病作用。药敏试验结果显示，该菌对环丙沙星、强力霉素、恩诺沙星、四环素等敏感；而对氨苄西林、先锋5号表现为耐药，从而为该病防治奠定了一定基础。
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关键字:支气管败血波氏杆菌；分离；鉴定
目录
摘要2
关键词 2
Abstract2
Key words2
引言2
1材料与方法2
1.1材料3
1.1.1病料来源3
1.1.2主要试剂及仪器3
1.1.3试验动物3
1.1.4受试药物3
1.2方法3
1.2.1细菌分离纯化3
1.2.2细菌生化试验4
1.2.3细菌生长曲线测定 4
1.2.4细菌CFU测定及活菌计数 4
1.2.5小鼠致病性试验 4
1.2.6细菌药敏试验4
2 结果与分析4
2.1菌落形态学及染色镜检4
2.2可疑菌株生化特性5
2.3细菌生长曲线测定5
2.4菌液活菌计数 5
2.5动物致病性试验6
2.6细菌药物敏感性6
3 讨论 6
参考文献7
致谢8
附 录
附录一 GN卡各孔成分 9
猪支气管败血波氏杆菌的分离与鉴定
引言
引言
猪支气管败血波氏杆菌（Brodetella bronchiseptica，Bb）能感染多种哺乳动物，引起呼吸道隐性感染及急慢性炎症[1]，同时也是引起猪传染性萎缩性鼻炎（non-progressive atrophic rhinitis，NPAR）的重要致病因子之一[2-3]。Bb广泛存在于正常猪上呼吸道、扁桃体等器官和组织中，猪群Bb的带菌率与猪群是否发生猪波氏菌病并无直接关系[4]。近年来，随着国内集约化养猪产业的蓬勃发展 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
，在生猪贸易过程中，生猪引种、商品猪屠宰、调动频繁，由Bb引起的NPAR和支气管肺炎也随之扩散蔓延，加大了防治该菌所引起疾病的难度[5]。该菌可单独或和其他病原菌协同致病，其传播方式为接触或飞沫传染，单独感染时，主要侵害仔猪，可导致猪支气管败血波氏菌病，1月龄内仔猪主要表现为鼻甲骨萎缩和支气管肺炎；6周后的仔猪感染主要表现为打喷嚏及鼻塞，不产生或者只产生轻度的鼻甲骨萎缩，但呈带菌状态[4]。如果感染Bb仔猪继发感染产毒多杀性巴氏杆菌，则会发生更严重的进行性萎缩性鼻炎[6]。该菌单独感染很少引起猪只死亡，故易被忽视，但该菌一旦传入某猪场，短时间又很难清除，给猪场的健康生产带来影响[7]。同时，该菌易与支原体、副猪嗜血杆菌、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等混合感染，引起猪呼吸道综合征，增加猪群病死率，给养猪业带来严重的经济损失[8]。
本研究从山东某猪场猪呼吸道综合征的仔猪肺脏病料中分离获得一株细菌，经生化系统鉴定为猪支气管败血波氏杆菌，并进行了药敏试验和小鼠攻毒试验，为该病防治提供了基础。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 病料来源
2014年3月7日，山东肥城天蓬府猪场呼吸道发病猪群发病仔猪肺脏病料。
1．1．2 主要试剂及仪器
胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）、胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)、磷酸缓冲液(PBS)和其他试剂均按常规方法制备，优级新生牛血清购自中美合资兰州民海生物工程有限公司，INCUBATOR MIR-262恒温箱为SANYO公司产品，恒温振荡器为江苏省太仓市强乐实验设备厂产品，SmartspecTM3000紫外分光光度计为Bio-RAD公司产品，ECLIPSE 50i显微镜为Nikon公司产品，全自动微生物鉴定/药敏分析仪（VITEK 2 COMPACT）为法国生物梅里埃公司产品。
1．1 . 3 试验动物
试验动物为20g左右，SPF级、ICR雌性小白鼠6只，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。
1．1 . 4 受试药物
强力毒素、环丙沙星、四环素、恩诺沙星、卡那霉素、阿莫西林、罗红霉素、红霉素、氨苄西林、先锋5号10种药物均购自杭州滨和微生物试剂有限公司。
1．2方法
1 . 2 . 1 细菌分离纯化
取患病仔猪肺脏病料，表明无菌处理后，用接种针取出支气管中少量粘液，接种于TSA培养基平板上，37℃培养过夜，挑取圆形、透明、直径约1 mm~2 mm烟灰色可疑菌落。取上述菌落做革兰氏染色，显微镜下观察。若镜检为革兰阴性杆菌，则挑取该菌落接种于含3%血清的3ml无菌TSB管中，置于37℃振荡器中振摇6h，取上述菌液涂片镜检，观察能否获得单一纯化的可疑目标菌，确定后，可通过三区划线的方法将该菌菌液接种于新的TSA平板上，再次进行分离、纯化，然后挑取单个菌落接种于新的TSB管中，置于37℃振摇器中振摇6h，将菌液置于4℃冰箱中备用。
1．2．2 细菌生化试验
取30ul纯化后的保存菌种液接种于无菌TSB管中，置于37℃振荡器中，振荡4h复壮，再通过三区划线的方法将该复壮菌液接种于TSA平板上，置于体积分数为5%的CO2培养箱，37℃培养18h，获得纯化的单个可疑菌菌落，送至江苏检验检疫 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
局动植物与食品检测中心做生化检测，该中心采用全自动微生物鉴定/药敏分析仪（VITEK 2 COMPACT）进行生化检测。
按照VITEK 2 COMPACT检测操作流程进行，挑取送检的可疑菌单个菌落加入0.45%Nacl溶液中配制成细菌悬液，调节PH到7左右备用。因可疑菌革兰氏染色成阴性，故选择革兰氏阴性杆菌鉴定卡（GN卡)进行检测，使用卡片前先将GN卡从冰箱取出，放室温15~20分钟，充分复温。然后在载卡架上放一个一次性塑料试管，向试管中加入3ml的0.45%NaCl溶液。再用比浊仪校正管校正比浊仪，确定数值应在规定范围内，将配置好的适量的细菌悬液移至菌液管中，并用比浊仪器测定菌液浓度，调节菌液浊度为0.5~0.63麦氏单位，然后把GN卡放入载卡架上，将输样管插入到菌液管中，再进入 VITEK 2 COMPACT应用软件主界面，扫描载卡架条码，并扫描试卡条码，然后点击“链接”按钮链接鉴定卡，输入送检可疑菌标本实验号和菌株编号，然后将载卡架放入仪器填充仓，按“充入”按钮后，1分钟左右填充完毕，填充完成后，将载卡架取出并放入孵育仓，仪器自动扫描条码，然后审核所输入的卡片信息是否正确，确认无误后自动进行封口和上卡，从而进行生化检测，该仪器每隔15分钟自动阅读孵育仓的卡片，并将数据传入工作电脑中，电脑分析所有数据并给予检测结果，然后按东秀珠（2001）等所述的标准[11]来判定结果。
1 . 2 . 3 细菌生长曲线测定
按裴洁（2006）等方法[9]测定可疑菌生长曲线，取30ul纯化后的保存菌种液接种于TSB管中，置于37℃振荡器中振摇过夜复壮，第二天取复壮菌液300ul接种于盛有30ml TSB的锥形瓶中，置于37℃振荡器中振摇培养，以接种时间为原点，此后每隔1小时为一个计数点，共计数11次；每次取菌液的量为500ul，12000rpm离心5min，弃去上清，沉淀的菌体用500ul无菌PBS溶液重悬，标记后置于4℃冰箱中备用。待各计数点菌液样品取完后，利用SmartspecTM3000紫外分光光度计测定各样品OD值。每个样品测定3次。绘制细菌生长曲线，计算出细菌K/2值所在的时间点。
摘要：本研究从山东某猪场送检的患呼吸道综合症仔猪的肺脏病料中分离获得1株细菌，经形态学观察、生化试验和小鼠致病性试验进行鉴定，结果证明，该分离菌为猪支气管败血波氏杆菌，1.09×104个活菌腹腔注射，对小鼠有致病作用。药敏试验结果显示，该菌对环丙沙星、强力霉素、恩诺沙星、四环素等敏感；而对氨苄西林、先锋5号表现为耐药，从而为该病防治奠定了一定基础。
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关键字:支气管败血波氏杆菌；分离；鉴定
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摘要2
关键词 2
Abstract2
Key words2
引言2
1材料与方法2
1.1材料3
1.1.1病料来源3
1.1.2主要试剂及仪器3
1.1.3试验动物3
1.1.4受试药物3
1.2方法3
1.2.1细菌分离纯化3
1.2.2细菌生化试验4
1.2.3细菌生长曲线测定 4
1.2.4细菌CFU测定及活菌计数 4
1.2.5小鼠致病性试验 4
1.2.6细菌药敏试验4
2 结果与分析4
2.1菌落形态学及染色镜检4
2.2可疑菌株生化特性5
2.3细菌生长曲线测定5
2.4菌液活菌计数 5
2.5动物致病性试验6
2.6细菌药物敏感性6
3 讨论 6
参考文献7
致谢8
附 录
附录一 GN卡各孔成分 9
猪支气管败血波氏杆菌的分离与鉴定
引言
引言
猪支气管败血波氏杆菌（Brodetella bronchiseptica，Bb）能感染多种哺乳动物，引起呼吸道隐性感染及急慢性炎症[1]，同时也是引起猪传染性萎缩性鼻炎（non-progressive atrophic rhinitis，NPAR）的重要致病因子之一[2-3]。Bb广泛存在于正常猪上呼吸道、扁桃体等器官和组织中，猪群Bb的带菌率与猪群是否发生猪波氏菌病并无直接关系[4]。近年来，随着国内集约化养猪产业的蓬勃发展 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
，在生猪贸易过程中，生猪引种、商品猪屠宰、调动频繁，由Bb引起的NPAR和支气管肺炎也随之扩散蔓延，加大了防治该菌所引起疾病的难度[5]。该菌可单独或和其他病原菌协同致病，其传播方式为接触或飞沫传染，单独感染时，主要侵害仔猪，可导致猪支气管败血波氏菌病，1月龄内仔猪主要表现为鼻甲骨萎缩和支气管肺炎；6周后的仔猪感染主要表现为打喷嚏及鼻塞，不产生或者只产生轻度的鼻甲骨萎缩，但呈带菌状态[4]。如果感染Bb仔猪继发感染产毒多杀性巴氏杆菌，则会发生更严重的进行性萎缩性鼻炎[6]。该菌单独感染很少引起猪只死亡，故易被忽视，但该菌一旦传入某猪场，短时间又很难清除，给猪场的健康生产带来影响[7]。同时，该菌易与支原体、副猪嗜血杆菌、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等混合感染，引起猪呼吸道综合征，增加猪群病死率，给养猪业带来严重的经济损失[8]。
本研究从山东某猪场猪呼吸道综合征的仔猪肺脏病料中分离获得一株细菌，经生化系统鉴定为猪支气管败血波氏杆菌，并进行了药敏试验和小鼠攻毒试验，为该病防治提供了基础。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 病料来源
2014年3月7日，山东肥城天蓬府猪场呼吸道发病猪群发病仔猪肺脏病料。
1．1．2 主要试剂及仪器
胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）、胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)、磷酸缓冲液(PBS)和其他试剂均按常规方法制备，优级新生牛血清购自中美合资兰州民海生物工程有限公司，INCUBATOR MIR-262恒温箱为SANYO公司产品，恒温振荡器为江苏省太仓市强乐实验设备厂产品，SmartspecTM3000紫外分光光度计为Bio-RAD公司产品，ECLIPSE 50i显微镜为Nikon公司产品，全自动微生物鉴定/药敏分析仪（VITEK 2 COMPACT）为法国生物梅里埃公司产品。
1．1 . 3 试验动物
试验动物为20g左右，SPF级、ICR雌性小白鼠6只，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。
1．1 . 4 受试药物
强力毒素、环丙沙星、四环素、恩诺沙星、卡那霉素、阿莫西林、罗红霉素、红霉素、氨苄西林、先锋5号10种药物均购自杭州滨和微生物试剂有限公司。
1．2方法
1 . 2 . 1 细菌分离纯化
取患病仔猪肺脏病料，表明无菌处理后，用接种针取出支气管中少量粘液，接种于TSA培养基平板上，37℃培养过夜，挑取圆形、透明、直径约1 mm~2 mm烟灰色可疑菌落。取上述菌落做革兰氏染色，显微镜下观察。若镜检为革兰阴性杆菌，则挑取该菌落接种于含3%血清的3ml无菌TSB管中，置于37℃振荡器中振摇6h，取上述菌液涂片镜检，观察能否获得单一纯化的可疑目标菌，确定后，可通过三区划线的方法将该菌菌液接种于新的TSA平板上，再次进行分离、纯化，然后挑取单个菌落接种于新的TSB管中，置于37℃振摇器中振摇6h，将菌液置于4℃冰箱中备用。
1．2．2 细菌生化试验
取30ul纯化后的保存菌种液接种于无菌TSB管中，置于37℃振荡器中，振荡4h复壮，再通过三区划线的方法将该复壮菌液接种于TSA平板上，置于体积分数为5%的CO2培养箱，37℃培养18h，获得纯化的单个可疑菌菌落，送至江苏检验检疫 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
局动植物与食品检测中心做生化检测，该中心采用全自动微生物鉴定/药敏分析仪（VITEK 2 COMPACT）进行生化检测。
按照VITEK 2 COMPACT检测操作流程进行，挑取送检的可疑菌单个菌落加入0.45%Nacl溶液中配制成细菌悬液，调节PH到7左右备用。因可疑菌革兰氏染色成阴性，故选择革兰氏阴性杆菌鉴定卡（GN卡)进行检测，使用卡片前先将GN卡从冰箱取出，放室温15~20分钟，充分复温。然后在载卡架上放一个一次性塑料试管，向试管中加入3ml的0.45%NaCl溶液。再用比浊仪校正管校正比浊仪，确定数值应在规定范围内，将配置好的适量的细菌悬液移至菌液管中，并用比浊仪器测定菌液浓度，调节菌液浊度为0.5~0.63麦氏单位，然后把GN卡放入载卡架上，将输样管插入到菌液管中，再进入 VITEK 2 COMPACT应用软件主界面，扫描载卡架条码，并扫描试卡条码，然后点击“链接”按钮链接鉴定卡，输入送检可疑菌标本实验号和菌株编号，然后将载卡架放入仪器填充仓，按“充入”按钮后，1分钟左右填充完毕，填充完成后，将载卡架取出并放入孵育仓，仪器自动扫描条码，然后审核所输入的卡片信息是否正确，确认无误后自动进行封口和上卡，从而进行生化检测，该仪器每隔15分钟自动阅读孵育仓的卡片，并将数据传入工作电脑中，电脑分析所有数据并给予检测结果，然后按东秀珠（2001）等所述的标准[11]来判定结果。
1 . 2 . 3 细菌生长曲线测定
按裴洁（2006）等方法[9]测定可疑菌生长曲线，取30ul纯化后的保存菌种液接种于TSB管中，置于37℃振荡器中振摇过夜复壮，第二天取复壮菌液300ul接种于盛有30ml TSB的锥形瓶中，置于37℃振荡器中振摇培养，以接种时间为原点，此后每隔1小时为一个计数点，共计数11次；每次取菌液的量为500ul，12000rpm离心5min，弃去上清，沉淀的菌体用500ul无菌PBS溶液重悬，标记后置于4℃冰箱中备用。待各计数点菌液样品取完后，利用SmartspecTM3000紫外分光光度计测定各样品OD值。每个样品测定3次。绘制细菌生长曲线，计算出细菌K/2值所在的时间点。
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