部分地区猪伪狂犬病毒株的分离鉴定及ge基因测序分析
为了解2014年以来，山东省部分地区猪场疑似猪伪狂犬病流行情况，查找病原解析其分子特点。将本实验室保存的来自山东青岛等不同地区的PRV阳性病料10份，分别接种PIEC细胞进行了分离、传代，各5个代次，并进行了PRV PCR检测、致细胞病变观察、病毒效价测定、可能的外源病毒污染情况检测，最后对分离出的4个毒株分别进行了gE全基因扩增、测序及分析。分离并获得PRV-SDDZ、PRV-SDLY、PRV-SDJM、PRV-SDJZ 4个地方流行毒株，均为流行野毒株（未缺失gE基因）； 4个可以致PIEC细胞在接种后24 h左右产生细胞圆缩、变大、拉网、破碎等明显的PRV特有的细胞病变（CPE），其病毒效价介于10-6.75～10-7.25。对这4个PRV地方流行株gE基因序列经在线Blast比对，进一步证实本研究所分离到的毒株就是PRV。这4个毒株与国外PRV毒株gE基因的核苷酸、推导氨基酸序列同源性为97.4%～97.9%；与国内PRV代表毒株Min-A株、Ea株gE基因的核苷酸、推导氨基酸序列同源性分别是99.2%～99.3%，99.2%～99.7%；与省内分离毒株LA株、TaiAn株、SDHZ株的gE基因的核苷酸、推导氨基酸序列同源性分别是99.0%～99.7%，98.8%～99.0%；与河北、河南、安徽等周边省份已发表PRV分离株gE基因的核苷酸、推导氨基酸序列同源性分别是99.0%～99.9%，99.3%～99.9%，98.7%～99.0%。从基于gE全基因构建的遗传发育进化树来看，4个分离株与8个国外毒株并不在一个进化分支上，而与周围省份及省内其他毒株在同一进化分支上。4个变异株均在 gE蛋白的第 48位和第52位存在1个天冬氨酸的插入,第 492位均缺失一个天冬氨酸。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract2
Key words2
引言3
1材料与方法4
1.1材料 4
1.2方法 5
1.2.1病料处理方法5
1.2.2病毒分离传代6
1.2.3病毒分离物鉴定7
1.2.4外源病毒测定8
1.2.5 PRV分离株全序列基因扩增8
1.2.6 PRVg *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
E基因演化分析8
2 结果 9
2.1 病毒分离结果9
2.2 PCR PRV结果10
2.3 病毒效价测定结果11
2.4 gE基因演化分析结果11
2.5 遗传演化分析结果12
3 讨论与分析14
致谢14
参考文献1516
山东省部分地区猪伪狂犬病毒株的分离、鉴定及gE基因测序分析
引言
伪狂犬病是由伪狂犬病毒引起，属于疱疹病毒科 (Herpesviridae)、疱疹病毒亚科，为双链 DNA，大小约为 150kb，编码 70～100种病毒蛋白。在众多的病毒蛋白中，gE糖蛋白位于 US区，是主要毒力因子之一 ，并且作为标志基因用来区分疫苗免疫和野毒感染[1.2]。伪狂犬自然发生于猪、牛、绵羊、犬和猫，另外，多种野生动物、肉食动物也易感[3]。猪是伪狂犬病毒的贮存宿主，病猪、带毒猪以及带毒鼠类为本病重要传染源[4]。伪狂犬病毒对除人类以外的哺乳动物都会产生致命的感染[5]。
猪发生伪狂犬病后，其临诊症状因日龄而异。对于新生仔猪伪狂犬病毒的感染往往是致命的，病因为中央神经系统的混乱。而对于成年猪该病毒主要引起应激反应，食欲下降，流产及死胎。成年猪虽不会死亡，但终生带毒具有传染性[6]。伪狂犬病的发生具有一定的季节性，多发生在寒冷的季节。在猪群中，病毒主要通过鼻分泌物传播，另外，乳汁和精液也是可能的传播方式[7]。
伪狂犬病对于产猪业是一种重要的疾病，许多欧洲国家和美国早已将其加入重点防制的项目[8]。伪狂犬病毒从多个方面影响猪的生产：猪的体重增长缓慢，生产率下降，生育能力降低，胎儿大量死亡，是对猪产业的重大经济打击[9]。如今，该病已经在包括美国的许多国家得到了有效控制[10、11、12],但伪狂犬病毒仍然在世界范围内广泛流行，对发展中国家造成大量经济损失，包括中国[13、14、15]。
在中国，首次报道的伪狂犬病毒爆发在上世纪50年代，BarthaK61疫苗在上世纪70年代从匈牙利进口到中国[16]。截止到2011年，中国超过80%的猪接种过BarthaK61疫苗，而且伪狂犬病得到了很好的控制[17]。但近几年来，许多使用gE基因缺失活疫苗免疫的规模化猪场出现了母猪产弱仔、死胎、流产，仔猪出现神经症状及死亡等疑似伪狂犬的临床症状。
PRV病毒包含72个基因可以编码70种不同的蛋白[18],gE基因是伪狂犬病毒的主要的致病基因，但却不影响病毒的复制[19]。因此，gE基因缺失苗（包括BarthaK61疫苗）可以有效抑制gE蛋白表达，对消灭伪狂犬病毒有重要意义[20]。而对伪狂犬病毒gE基因的分析研究就十分重要。
本研究对来自山东不同市的临床疑似猪伪狂犬病发病猪场的样品进行了PRV分离、传代、鉴定及gE测序分析，以了解不同地区PRV的遗传演化特点，为该病的防控提供决策依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料 组织样品10份，分别来自青岛、威海、烟台、潍坊、济南、济宁等市临床猪腹泻发病场，每份样品主要包括脾脏、淋巴结、脑组织等。经本实验室PRV、PEDV、TGEV、PROV检测，仅PRV核酸阳性，－70 ℃保存备用。
1.1.2 细胞及培养基 PIEC细胞（猪髋动脉内皮细胞）由中国动物卫生与流行病中心畜病监测室保存并提供。培养基为OptiMEM，购自Life公司，培养细胞时加入5%的胎牛血清（不含BVDV），1%青、链霉素，按常规方法培养。
1.1.3 引物 本研究所用引物如下表1。
表1 本研究所用引物
引物名称
引物序列
退火温度
预期片段大小
gETF
TCCACTCgCAgCTCTTCTCg
63℃
632 bp
gETR
gCACgTCATCACgAAggAgC
gEF
ACACACCggggTTgAgACCAT
63℃
1826 bp
gER
ggTCAAACgTgTCCATgTCgAC
1.1.4 PRV参考毒株基因序列 参考毒株共25个，其中，国外毒株10个，山东省及相邻省份已发表毒株15个，具体见下表2
表2 本研究所用PRV参考毒株gE基因
毒株代号
GenBank登陆号
毒株代号
GenBank登陆号
KF360829
AHBZ2012
EU561349
HNJZ
KF360830
HBCX2013
KF360835
AY170318
KF360831
SDHZ2012
AY249861
AY173124
KF360833
HN20111
KF010501
HNXX2012
KM983048
TaiAn
KF010499
HNBA2012
KF010500
HNHB2012
KC415026
HBBD
KC415029
HBLF
AF171937
Ea
AF207700
PRVSH
BK001744
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract2
Key words2
引言3
1材料与方法4
1.1材料 4
1.2方法 5
1.2.1病料处理方法5
1.2.2病毒分离传代6
1.2.3病毒分离物鉴定7
1.2.4外源病毒测定8
1.2.5 PRV分离株全序列基因扩增8
1.2.6 PRVg *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
E基因演化分析8
2 结果 9
2.1 病毒分离结果9
2.2 PCR PRV结果10
2.3 病毒效价测定结果11
2.4 gE基因演化分析结果11
2.5 遗传演化分析结果12
3 讨论与分析14
致谢14
参考文献1516
山东省部分地区猪伪狂犬病毒株的分离、鉴定及gE基因测序分析
引言
伪狂犬病是由伪狂犬病毒引起，属于疱疹病毒科 (Herpesviridae)、疱疹病毒亚科，为双链 DNA，大小约为 150kb，编码 70～100种病毒蛋白。在众多的病毒蛋白中，gE糖蛋白位于 US区，是主要毒力因子之一 ，并且作为标志基因用来区分疫苗免疫和野毒感染[1.2]。伪狂犬自然发生于猪、牛、绵羊、犬和猫，另外，多种野生动物、肉食动物也易感[3]。猪是伪狂犬病毒的贮存宿主，病猪、带毒猪以及带毒鼠类为本病重要传染源[4]。伪狂犬病毒对除人类以外的哺乳动物都会产生致命的感染[5]。
猪发生伪狂犬病后，其临诊症状因日龄而异。对于新生仔猪伪狂犬病毒的感染往往是致命的，病因为中央神经系统的混乱。而对于成年猪该病毒主要引起应激反应，食欲下降，流产及死胎。成年猪虽不会死亡，但终生带毒具有传染性[6]。伪狂犬病的发生具有一定的季节性，多发生在寒冷的季节。在猪群中，病毒主要通过鼻分泌物传播，另外，乳汁和精液也是可能的传播方式[7]。
伪狂犬病对于产猪业是一种重要的疾病，许多欧洲国家和美国早已将其加入重点防制的项目[8]。伪狂犬病毒从多个方面影响猪的生产：猪的体重增长缓慢，生产率下降，生育能力降低，胎儿大量死亡，是对猪产业的重大经济打击[9]。如今，该病已经在包括美国的许多国家得到了有效控制[10、11、12],但伪狂犬病毒仍然在世界范围内广泛流行，对发展中国家造成大量经济损失，包括中国[13、14、15]。
在中国，首次报道的伪狂犬病毒爆发在上世纪50年代，BarthaK61疫苗在上世纪70年代从匈牙利进口到中国[16]。截止到2011年，中国超过80%的猪接种过BarthaK61疫苗，而且伪狂犬病得到了很好的控制[17]。但近几年来，许多使用gE基因缺失活疫苗免疫的规模化猪场出现了母猪产弱仔、死胎、流产，仔猪出现神经症状及死亡等疑似伪狂犬的临床症状。
PRV病毒包含72个基因可以编码70种不同的蛋白[18],gE基因是伪狂犬病毒的主要的致病基因，但却不影响病毒的复制[19]。因此，gE基因缺失苗（包括BarthaK61疫苗）可以有效抑制gE蛋白表达，对消灭伪狂犬病毒有重要意义[20]。而对伪狂犬病毒gE基因的分析研究就十分重要。
本研究对来自山东不同市的临床疑似猪伪狂犬病发病猪场的样品进行了PRV分离、传代、鉴定及gE测序分析，以了解不同地区PRV的遗传演化特点，为该病的防控提供决策依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料 组织样品10份，分别来自青岛、威海、烟台、潍坊、济南、济宁等市临床猪腹泻发病场，每份样品主要包括脾脏、淋巴结、脑组织等。经本实验室PRV、PEDV、TGEV、PROV检测，仅PRV核酸阳性，－70 ℃保存备用。
1.1.2 细胞及培养基 PIEC细胞（猪髋动脉内皮细胞）由中国动物卫生与流行病中心畜病监测室保存并提供。培养基为OptiMEM，购自Life公司，培养细胞时加入5%的胎牛血清（不含BVDV），1%青、链霉素，按常规方法培养。
1.1.3 引物 本研究所用引物如下表1。
表1 本研究所用引物
引物名称
引物序列
退火温度
预期片段大小
gETF
TCCACTCgCAgCTCTTCTCg
63℃
632 bp
gETR
gCACgTCATCACgAAggAgC
gEF
ACACACCggggTTgAgACCAT
63℃
1826 bp
gER
ggTCAAACgTgTCCATgTCgAC
1.1.4 PRV参考毒株基因序列 参考毒株共25个，其中，国外毒株10个，山东省及相邻省份已发表毒株15个，具体见下表2
表2 本研究所用PRV参考毒株gE基因
毒株代号
GenBank登陆号
毒株代号
GenBank登陆号
KF360829
AHBZ2012
EU561349
HNJZ
KF360830
HBCX2013
KF360835
AY170318
KF360831
SDHZ2012
AY249861
AY173124
KF360833
HN20111
KF010501
HNXX2012
KM983048
TaiAn
KF010499
HNBA2012
KF010500
HNHB2012
KC415026
HBBD
KC415029
HBLF
AF171937
Ea
AF207700
PRVSH
BK001744
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/yxlw/dwyx/631.html
