3株猪繁殖与呼吸综合征病毒的全基因组测定与分析(附件)
猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）是引起猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome）的病原。该病自1987年在美国暴发以来已迅速蔓延至全球各主要养猪国家，成为严重危害世界养猪业的传染病之一，流行毒株遗传变异分析，对猪繁殖与呼吸综合征的预防和控制非常重要。该研究收集了三个不同地区的3份感染 PRRSV的组织样品，通过RT-PCR扩增了他们的基因组全长，并且对ORF5和Nsp2基因片段进行遗传进化分析，发现三株病毒均属于近年来在我国出现的NADC30-like毒株。3株PRRSV全基因序列的测定为丰富PRRSV基因序列数据库，PRRSV的致病机理，流行病学调查，基因组结构与功能的研究等提供了基础数据。
目录
摘要 4
关键词 4
Abstract 5
Key words 5
引言 4
1 材料与方法 5
1．1 材料 5
1．1．1 样品采集 5
1．1．2 RTPCR 检测及鉴定所用试剂 5
1．1．3 分析生物学软件 5
1．1．4 主要仪器设备 5
1．1．4 主要仪器设备 5
1．1．5 培养基及抗生素和相关溶液的配制 6
培养基及抗生素和相关溶液的配制 6
1．1．6 分析用 PRRSV 全基因序列 6
1．2 方法 7
1．2．1 病毒 RNA 的提取 7
1．2．2 引物设计与合成 7
1．2．3 反转录 7
1．2．4 PCR扩增 7
1．2．5 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳 8
1．2．6 PCR 产物的回收纯化 8
1．2．7 PCR 产物的连接，转化 9
1．2．8 菌落鉴定 9
1．2．9 序列测定与拼接 9
1．2．10 基因组结构分析 9
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
1．2．11 系统进化树的绘制 9
2 结果与分析 9
2．1 三株PRRSV毒株的基因组片段RTPCR 扩增 9
2．1．1 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳结果 9
2．1．2 菌落鉴定结果 10
2．2 全基因的扩增、克隆与序列分析 11
2．3 Nsp2基因核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性比较 12
2．4 基于Nsp2构建分离毒株遗传进化树 13
2．5 ORF5基因核苷酸和氨基酸序列的相似性比较 14
2．6 ORF5基因编码氨基酸序列分析 15
2．7 基于ORF5构建分离毒株遗传进化树 16
3 讨论和结论 17
3．1 讨论 17
3．2 结论 17
参考文献： 18
3株猪繁殖与呼吸综合征病毒的全基因序列测定与分析
引言
猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome， PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV）引起的一种猪繁殖障碍和呼吸系统高度接触性传染性疾病[1]。其特征为母猪厌食、发热，妊娠后期发生流产，产死胎和木乃伊胎[2]；仔猪发生呼吸系统疾病和大量死亡，高致病性毒株可以引起成年猪发热、皮肤发红、呼吸困难和急性死亡[3]。由于部分病猪耳部发紫，故俗称称“猪蓝耳病”（Blueear disease）[4]。PRRSV被归类于套式病毒目（Nidovirales）、动脉炎病毒科（Arteriviridae）、动脉炎病毒属（Arterivirus）[5]。PRRSV分为欧洲洲型和美洲型两个血清型，前者又称为血清1型，后者称为血清2型，欧洲型代表毒株为 Lelystad病毒（LV），美洲型代表毒株为VR2332[6]。该病于1987在美国中西部发现，随后在加拿大、德国、法国、荷兰、英国、西班牙、比利时、澳大利亚、日本、菲律宾等国家相继发生[7]。我国台湾地区1991年出现此病，1996 年郭宝清等首次在国内分离和鉴定了该病毒[8]。2006年病毒出现明显变异，引起成年猪发热、呼吸困难和大量急性死亡，即所谓的高致病性猪蓝耳病（HPPRRSV）[9]。自2012年开始，国内陆续分离到与美国NADC30基因同源性较高的毒株，如HENANXINX、HENANHEB、JL580、CHSX1401等[1012]，由于与NADC30毒株遗传进化关系较近，目前国内现将该类病毒统称为PRRS类NADC30毒株（NADC30like毒株）[1315]。2014年以来，PRRSV类NADC30毒株在我国流行呈现出加剧趋势，疫情涉及地区包括北京、天津、河北、山东、山两、河南、江苏、浙江、福建、四川、湖北、广东等地[16]，临床检出率高，可能已成为PRRSV主要流行毒株，给我国生猪养殖带来了新的挑战[1013]。本研究对2018年江苏，浙江和山东地区的三个猪场进行疑似感染 PRRSV的组织样品取样，全基因组扩增测定，并对毒株的基因变异、亲缘关系以及与疫苗株的相似性对阐明流行毒株的遗传演化规律，以及今后 PRRSV疫苗株的选择提供重要的理论依据。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 样品采集
样品来自2018年江苏徐州、浙江和山东地区疑似感染PRRSV的发病猪场，送至江苏省农业科学院兽医研究所做检测的病猪肺脏和血清。
1．1．2 RTPCR 检测及鉴定所用试剂 见表11。
1．1．3 分析生物学软件 见表11。
Primer 5.0，BioEdit， DNA Star ，MEGA7.0等生物学软件由本实验室提供。
1．1．4 主要仪器设备
表11 主要试剂和仪器设备
目录
摘要 4
关键词 4
Abstract 5
Key words 5
引言 4
1 材料与方法 5
1．1 材料 5
1．1．1 样品采集 5
1．1．2 RTPCR 检测及鉴定所用试剂 5
1．1．3 分析生物学软件 5
1．1．4 主要仪器设备 5
1．1．4 主要仪器设备 5
1．1．5 培养基及抗生素和相关溶液的配制 6
培养基及抗生素和相关溶液的配制 6
1．1．6 分析用 PRRSV 全基因序列 6
1．2 方法 7
1．2．1 病毒 RNA 的提取 7
1．2．2 引物设计与合成 7
1．2．3 反转录 7
1．2．4 PCR扩增 7
1．2．5 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳 8
1．2．6 PCR 产物的回收纯化 8
1．2．7 PCR 产物的连接，转化 9
1．2．8 菌落鉴定 9
1．2．9 序列测定与拼接 9
1．2．10 基因组结构分析 9
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
1．2．11 系统进化树的绘制 9
2 结果与分析 9
2．1 三株PRRSV毒株的基因组片段RTPCR 扩增 9
2．1．1 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳结果 9
2．1．2 菌落鉴定结果 10
2．2 全基因的扩增、克隆与序列分析 11
2．3 Nsp2基因核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性比较 12
2．4 基于Nsp2构建分离毒株遗传进化树 13
2．5 ORF5基因核苷酸和氨基酸序列的相似性比较 14
2．6 ORF5基因编码氨基酸序列分析 15
2．7 基于ORF5构建分离毒株遗传进化树 16
3 讨论和结论 17
3．1 讨论 17
3．2 结论 17
参考文献： 18
3株猪繁殖与呼吸综合征病毒的全基因序列测定与分析
引言
猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome， PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV）引起的一种猪繁殖障碍和呼吸系统高度接触性传染性疾病[1]。其特征为母猪厌食、发热，妊娠后期发生流产，产死胎和木乃伊胎[2]；仔猪发生呼吸系统疾病和大量死亡，高致病性毒株可以引起成年猪发热、皮肤发红、呼吸困难和急性死亡[3]。由于部分病猪耳部发紫，故俗称称“猪蓝耳病”（Blueear disease）[4]。PRRSV被归类于套式病毒目（Nidovirales）、动脉炎病毒科（Arteriviridae）、动脉炎病毒属（Arterivirus）[5]。PRRSV分为欧洲洲型和美洲型两个血清型，前者又称为血清1型，后者称为血清2型，欧洲型代表毒株为 Lelystad病毒（LV），美洲型代表毒株为VR2332[6]。该病于1987在美国中西部发现，随后在加拿大、德国、法国、荷兰、英国、西班牙、比利时、澳大利亚、日本、菲律宾等国家相继发生[7]。我国台湾地区1991年出现此病，1996 年郭宝清等首次在国内分离和鉴定了该病毒[8]。2006年病毒出现明显变异，引起成年猪发热、呼吸困难和大量急性死亡，即所谓的高致病性猪蓝耳病（HPPRRSV）[9]。自2012年开始，国内陆续分离到与美国NADC30基因同源性较高的毒株，如HENANXINX、HENANHEB、JL580、CHSX1401等[1012]，由于与NADC30毒株遗传进化关系较近，目前国内现将该类病毒统称为PRRS类NADC30毒株（NADC30like毒株）[1315]。2014年以来，PRRSV类NADC30毒株在我国流行呈现出加剧趋势，疫情涉及地区包括北京、天津、河北、山东、山两、河南、江苏、浙江、福建、四川、湖北、广东等地[16]，临床检出率高，可能已成为PRRSV主要流行毒株，给我国生猪养殖带来了新的挑战[1013]。本研究对2018年江苏，浙江和山东地区的三个猪场进行疑似感染 PRRSV的组织样品取样，全基因组扩增测定，并对毒株的基因变异、亲缘关系以及与疫苗株的相似性对阐明流行毒株的遗传演化规律，以及今后 PRRSV疫苗株的选择提供重要的理论依据。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 样品采集
样品来自2018年江苏徐州、浙江和山东地区疑似感染PRRSV的发病猪场，送至江苏省农业科学院兽医研究所做检测的病猪肺脏和血清。
1．1．2 RTPCR 检测及鉴定所用试剂 见表11。
1．1．3 分析生物学软件 见表11。
Primer 5.0，BioEdit， DNA Star ，MEGA7.0等生物学软件由本实验室提供。
1．1．4 主要仪器设备
表11 主要试剂和仪器设备
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