猪流行性乙型脑炎病毒蛋白EDⅢ单克隆抗体的表位鉴定研究
猪流行性乙型脑炎病毒蛋白EDⅢ单克隆抗体的表位鉴定研究[20200507184441]
摘要：乙型脑炎病毒（JEV）E蛋白结构域Ⅲ有许多中和表位，单克隆抗体对病毒蛋白的反应具有特异性。本研究旨在利用单克隆抗体的特异性反应，鉴定EDⅢ蛋白的表位，本研究设计并合成了病毒蛋白EDⅢ的基因片段及合成了抗原肽，构建原核表达载体，通过Western blot和ELISA方法鉴定研究了单克隆抗体作用的表位，为乙脑病毒的进一步研究打下基础，同时为基因工程疫苗、免疫胶体金诊断等提供理论依据。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
关键字:乙型脑炎病毒；EDⅢ；抗原表位；单克隆抗体
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）3
1材料与方法4
1.1材料 4
1.2原核表达重组质粒的构建及鉴定5
1.3病毒蛋白EDⅢ单克隆抗体与病毒蛋白EDⅢ、乙脑病毒以及225bp、171bp表达产物蛋白的western blot8
1.4合成多肽ELISA9
1．5原核表达重组质粒的构建及鉴定10
1.6病毒蛋白EDⅢ单克隆抗体与病毒蛋白EDⅢ、乙脑病毒以及225bp、171bp表达产物蛋白的western blot11
2 结果与分析12
2．1原核表达重组质粒的构建和鉴定12
2.2乙脑病毒EDⅢ蛋白单克隆抗体的Western blotting13
2．3合成抗原多肽的ELISA反应14
2．4原核表达载体的构建与鉴定15
2.5乙脑病毒EDⅢ蛋白单克隆抗体的Western blotting15
致谢17
参考文献17
猪流行性乙型脑炎病毒蛋白EDⅢ单克隆抗体的表位鉴定研究
引言
引言
流行性乙型脑炎（Japanese encephalitis，JE）简称乙脑，是由黄病毒科黄病毒属的乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）引起，主要侵害中枢神经系统的一种人畜共患自然疫源性急性传染病[1]。JEV基因组为单股正链RNA分子。编码含3432个氨基酸的多蛋白前体,无亚基因结构。其分为核衣壳蛋白(C)、囊膜蛋白(E)、膜前体/膜蛋白(PrM *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
/M)的结构蛋白和NS1，NS2a，NS2b，NS3，NS4a，NS4b和NS5的非结构蛋白 [2] 。
囊膜蛋白（Envelope，E）是病毒主要的结构蛋白，是主要的抗原成分。由500个氨基酸残基组成,该蛋白是JEV的重要抗原蛋白,具有与细胞表面受体结合的能力并诱导机体产生中和抗体,因此E蛋白与病毒毒力、致病性和免疫保护等密切相关。E蛋白由3个抗原域和411个氨基酸组成：域Ⅰ、域Ⅱ、域Ⅲ。其中域Ⅲ能够独立的在病毒表面折叠成为免疫球蛋白样的结构，与受体的结合密切相关[3]。
E蛋白上含有乙脑病毒的中和抗原表位,可刺激动物机体产生中和抗体。此外,E蛋白在病毒的吸附、病毒血凝、细胞趋向性、诱导保护性免疫反应中起重要作用[4]。抗E蛋白的单抗有很高的中和活性,通过影响病毒与细胞膜的相互融合,阻止病毒进入细胞内,从而对乙脑病毒的感染有很强的保护作用[5]。
动物医学院传染病实验室现具有针对猪乙型脑炎病毒EDⅢ蛋白单克隆抗体。本实验利用PCR技术扩增了乙脑病毒EDⅢ蛋白基因片段,并构建了相应的原核表达载体PGEx-6p-1-X（X为所扩增的片段）。利用Western blot方法、抗原多肽ELISA方法等鉴定单克隆抗体作用的表位。乙脑病毒单克隆表位的鉴定是对病毒做进一步研究的基础，基因工程疫苗、免疫胶体金诊断等均依赖于病毒表位研究的基础之上。同时，表位鉴定对进一步研究EDⅢ蛋白的生物学功能也具有重要的作用。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1材料
菌种、质粒、病毒以及蛋白：DH5α大肠杆菌、Rosetta2 ( DE3) 大肠杆菌，PGEx-6p-1原核表达载体由农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室保存。猪乙型脑炎病毒强毒株NJ08株、猪乙型脑炎病毒EDⅢ蛋白、猪乙型脑炎病毒EDⅢ蛋白单克隆抗体均由本实验室保存。
1．1．2主要试剂与工具酶
TaKaRa LA TaqTM, pMD18-T simple载体试剂盒、M-MLV反转录酶、蛋白质分子量标准（低）、PrimeScript? RT Marster Mix(Perfect RealTime), SYBR? Premix Ex Taq?II等均购自TaKaRa(大连)公司；
BamHⅠ, XhoⅠ限制性内切酶 (New England Biolabs, NEB, 英国)；
孔径0.45μm的NC膜（南京鼎国生物技术有限公司，中国）；
Gene ray公司质粒DNA小量制备试剂盒
Gene ray公司Gen Clean柱式琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒
DAB显色试剂盒购自武汉博士德公司；
封闭蛋白干粉（武汉博士德生物工程有限公司，中国）
预染蛋白质分子量标准（Fermentas，立陶宛）；
羊抗鼠IgG-HRP（Santa Cruz, 美国）；
DAPI染色液（碧云天生物技术研究所，中国）；
West Pico化学发光试剂盒（Thermo scientific, 德国）；
其他试剂均为进口或国产分析纯。
1．1．3 主要仪器设备
PC *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
R仪(TAKARA, 日本)
恒温培养摇床（江苏太仓华利达实验设备有限公司，中国）
HH一60型快速恒温循环水浴锅（重庆科学仪器厂，中国）
生物洁净工作台BCM-1000A（苏州安泰空气技术有限公司，中国）
ZDX-35 BI型自动电热压力蒸汽高压锅（上海申安医疗器械厂，中国）
二氧化碳恒温培养箱（Thermo Scientific, 美国）
4℃台式高速离心机（Thermo Scientific, 美国）
SCR-6 型稳定稳压电泳仪（江苏丹阳无线电厂，中国）
THZ-C恒温震荡器（江苏太仓光明实验分析仪器，中国）
TY-80S型脱色摇床（南京大学南达生物技术开发公司产品，中国 ）
1．2原核表达重组质粒的构建及鉴定
1．2．1载体基本信息
PGEx-6p-1载体是大肠杆菌蛋白高拷贝的表达载体，大小为4984bp，氨苄抗性，质粒图谱和多克隆位点信息如下图：
1．2．2制备DH5α感受态细胞；取100μLDH5α菌液于5mL液体LB培养基中，37℃摇床摇1-2h，使之呈云雾状即可，冰浴15min；无菌取1mL菌液至灭菌EP管中，5600rpm，4℃，5min离心（注意用封口膜封口）；弃去上清液，用移液器吸出残液；加入冰浴的0.1MCaCl2400-500μL重悬，冰浴至少30min（注意用封口膜封口）；5600rpm，4℃，5min离心。弃去上清液，用移液器将残液吸出；加入200μL冰浴的0.1MCaCl2重悬，轻柔一些；4℃放置至少2h后使用（1周内使用）。
1．2．3将PGEx-6p-1质粒转化：将连接产物10μL全部加入到制备好的感受态细胞中，弹下管壁，冰浴30min，连接产物即经修饰，加工后的质粒；42℃热击90s，不摇动；冰上放置2-3min；无菌加入800μL液体LB，37℃摇菌，一般45min左右，也可较长时间；4℃，5600rpm离心5min，弃去上清，加入100μL无菌LB悬浮。将菌液涂布到氨苄抗性平板上37℃过夜培养，1-2h翻板；挑取单个菌落，加入千分之一抗生素，37℃过夜摇菌；提取质粒，获取扩增的PGEx-6p-1。
摘要：乙型脑炎病毒（JEV）E蛋白结构域Ⅲ有许多中和表位，单克隆抗体对病毒蛋白的反应具有特异性。本研究旨在利用单克隆抗体的特异性反应，鉴定EDⅢ蛋白的表位，本研究设计并合成了病毒蛋白EDⅢ的基因片段及合成了抗原肽，构建原核表达载体，通过Western blot和ELISA方法鉴定研究了单克隆抗体作用的表位，为乙脑病毒的进一步研究打下基础，同时为基因工程疫苗、免疫胶体金诊断等提供理论依据。
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关键字:乙型脑炎病毒；EDⅢ；抗原表位；单克隆抗体
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）3
1材料与方法4
1.1材料 4
1.2原核表达重组质粒的构建及鉴定5
1.3病毒蛋白EDⅢ单克隆抗体与病毒蛋白EDⅢ、乙脑病毒以及225bp、171bp表达产物蛋白的western blot8
1.4合成多肽ELISA9
1．5原核表达重组质粒的构建及鉴定10
1.6病毒蛋白EDⅢ单克隆抗体与病毒蛋白EDⅢ、乙脑病毒以及225bp、171bp表达产物蛋白的western blot11
2 结果与分析12
2．1原核表达重组质粒的构建和鉴定12
2.2乙脑病毒EDⅢ蛋白单克隆抗体的Western blotting13
2．3合成抗原多肽的ELISA反应14
2．4原核表达载体的构建与鉴定15
2.5乙脑病毒EDⅢ蛋白单克隆抗体的Western blotting15
致谢17
参考文献17
猪流行性乙型脑炎病毒蛋白EDⅢ单克隆抗体的表位鉴定研究
引言
引言
流行性乙型脑炎（Japanese encephalitis，JE）简称乙脑，是由黄病毒科黄病毒属的乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）引起，主要侵害中枢神经系统的一种人畜共患自然疫源性急性传染病[1]。JEV基因组为单股正链RNA分子。编码含3432个氨基酸的多蛋白前体,无亚基因结构。其分为核衣壳蛋白(C)、囊膜蛋白(E)、膜前体/膜蛋白(PrM *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
/M)的结构蛋白和NS1，NS2a，NS2b，NS3，NS4a，NS4b和NS5的非结构蛋白 [2] 。
囊膜蛋白（Envelope，E）是病毒主要的结构蛋白，是主要的抗原成分。由500个氨基酸残基组成,该蛋白是JEV的重要抗原蛋白,具有与细胞表面受体结合的能力并诱导机体产生中和抗体,因此E蛋白与病毒毒力、致病性和免疫保护等密切相关。E蛋白由3个抗原域和411个氨基酸组成：域Ⅰ、域Ⅱ、域Ⅲ。其中域Ⅲ能够独立的在病毒表面折叠成为免疫球蛋白样的结构，与受体的结合密切相关[3]。
E蛋白上含有乙脑病毒的中和抗原表位,可刺激动物机体产生中和抗体。此外,E蛋白在病毒的吸附、病毒血凝、细胞趋向性、诱导保护性免疫反应中起重要作用[4]。抗E蛋白的单抗有很高的中和活性,通过影响病毒与细胞膜的相互融合,阻止病毒进入细胞内,从而对乙脑病毒的感染有很强的保护作用[5]。
动物医学院传染病实验室现具有针对猪乙型脑炎病毒EDⅢ蛋白单克隆抗体。本实验利用PCR技术扩增了乙脑病毒EDⅢ蛋白基因片段,并构建了相应的原核表达载体PGEx-6p-1-X（X为所扩增的片段）。利用Western blot方法、抗原多肽ELISA方法等鉴定单克隆抗体作用的表位。乙脑病毒单克隆表位的鉴定是对病毒做进一步研究的基础，基因工程疫苗、免疫胶体金诊断等均依赖于病毒表位研究的基础之上。同时，表位鉴定对进一步研究EDⅢ蛋白的生物学功能也具有重要的作用。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1材料
菌种、质粒、病毒以及蛋白：DH5α大肠杆菌、Rosetta2 ( DE3) 大肠杆菌，PGEx-6p-1原核表达载体由农业部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室保存。猪乙型脑炎病毒强毒株NJ08株、猪乙型脑炎病毒EDⅢ蛋白、猪乙型脑炎病毒EDⅢ蛋白单克隆抗体均由本实验室保存。
1．1．2主要试剂与工具酶
TaKaRa LA TaqTM, pMD18-T simple载体试剂盒、M-MLV反转录酶、蛋白质分子量标准（低）、PrimeScript? RT Marster Mix(Perfect RealTime), SYBR? Premix Ex Taq?II等均购自TaKaRa(大连)公司；
BamHⅠ, XhoⅠ限制性内切酶 (New England Biolabs, NEB, 英国)；
孔径0.45μm的NC膜（南京鼎国生物技术有限公司，中国）；
Gene ray公司质粒DNA小量制备试剂盒
Gene ray公司Gen Clean柱式琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒
DAB显色试剂盒购自武汉博士德公司；
封闭蛋白干粉（武汉博士德生物工程有限公司，中国）
预染蛋白质分子量标准（Fermentas，立陶宛）；
羊抗鼠IgG-HRP（Santa Cruz, 美国）；
DAPI染色液（碧云天生物技术研究所，中国）；
West Pico化学发光试剂盒（Thermo scientific, 德国）；
其他试剂均为进口或国产分析纯。
1．1．3 主要仪器设备
PC *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
R仪(TAKARA, 日本)
恒温培养摇床（江苏太仓华利达实验设备有限公司，中国）
HH一60型快速恒温循环水浴锅（重庆科学仪器厂，中国）
生物洁净工作台BCM-1000A（苏州安泰空气技术有限公司，中国）
ZDX-35 BI型自动电热压力蒸汽高压锅（上海申安医疗器械厂，中国）
二氧化碳恒温培养箱（Thermo Scientific, 美国）
4℃台式高速离心机（Thermo Scientific, 美国）
SCR-6 型稳定稳压电泳仪（江苏丹阳无线电厂，中国）
THZ-C恒温震荡器（江苏太仓光明实验分析仪器，中国）
TY-80S型脱色摇床（南京大学南达生物技术开发公司产品，中国 ）
1．2原核表达重组质粒的构建及鉴定
1．2．1载体基本信息
PGEx-6p-1载体是大肠杆菌蛋白高拷贝的表达载体，大小为4984bp，氨苄抗性，质粒图谱和多克隆位点信息如下图：
1．2．2制备DH5α感受态细胞；取100μLDH5α菌液于5mL液体LB培养基中，37℃摇床摇1-2h，使之呈云雾状即可，冰浴15min；无菌取1mL菌液至灭菌EP管中，5600rpm，4℃，5min离心（注意用封口膜封口）；弃去上清液，用移液器吸出残液；加入冰浴的0.1MCaCl2400-500μL重悬，冰浴至少30min（注意用封口膜封口）；5600rpm，4℃，5min离心。弃去上清液，用移液器将残液吸出；加入200μL冰浴的0.1MCaCl2重悬，轻柔一些；4℃放置至少2h后使用（1周内使用）。
1．2．3将PGEx-6p-1质粒转化：将连接产物10μL全部加入到制备好的感受态细胞中，弹下管壁，冰浴30min，连接产物即经修饰，加工后的质粒；42℃热击90s，不摇动；冰上放置2-3min；无菌加入800μL液体LB，37℃摇菌，一般45min左右，也可较长时间；4℃，5600rpm离心5min，弃去上清，加入100μL无菌LB悬浮。将菌液涂布到氨苄抗性平板上37℃过夜培养，1-2h翻板；挑取单个菌落，加入千分之一抗生素，37℃过夜摇菌；提取质粒，获取扩增的PGEx-6p-1。
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