猪链球菌9型lysm结构蛋白对小鼠免疫保护评价

目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1 动物、菌株与培养条件2
1.2 试剂与仪器 2
1.3 方法 2
1.3.1 LysM氨基酸序列在猪链球菌中同源性分析2
1.3.1.1 获得各菌种氨基酸序列2
1.3.1.2 同源性比对分析3
1.3.2 纯化SS9LysM蛋白3
1.3.3 LysM免疫小鼠及血清抗体效价测定3
1.3.4 小鼠存活曲线测定4
2结果4
2.1 LysM氨基酸序列在猪链球菌中同源性分析4
2.2 纯化SS9LysM蛋白5
2.3 LysM免疫小鼠及血清抗体效价测定5
2.4小鼠存活曲线测定6
3讨论6
致谢7
参考文献7
猪链球菌9型LysM结构蛋白对小鼠免疫保护评价
动物药学 代娇
引言
猪链球菌（Streptococcus suis）是一种革兰氏阳性菌，在全世界广泛分布，可以引起猪的急性败血症、脑膜炎、关节炎及急性死亡，也可导致生猪从业人员感染和死亡，是一种人畜共患病原[13]。猪链球菌一般分为33个血清型，除猪链球菌2型（SS2）外，猪链球菌9型（SS9）也是一个重要致病血清型，从许多国家的病猪中被分离到[46]。目前有关疫苗研究主要针对SS2，相比较而言，SS9疫苗的研究则很少。
疫苗研制是防控猪链球菌病的有效手段。已报道的一些灭活苗与减毒疫苗的免疫效果不尽如人意。免疫失败的原因可能有以下几个方面：由于通过福尔马林等方式灭活导致细菌的保护性抗原降解或者丢失；产生的抗体与毒力因子无关；不同血清型之间或同一血清型不同菌株之间免疫交叉保护力很有限等[3]。虽然荚膜多糖（CPS）是猪链球菌重要的毒力因子，但由于CPS免疫原性低，由它制成的疫苗效果也不理想[7]。因此，寻找在猪链球菌中保守的免疫原性蛋白，特别是表面蛋白将有助于亚单位疫苗的研制。
本课题通过分析SS9L *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥ 
ysM氨基酸序列在猪链球菌中的同源性，利用重组蛋白上的Histag纯化SS9LysM重组蛋白并免疫小鼠，通过小鼠免疫保护实验评价该蛋白免疫保护性，为猪链球菌疫苗研制及该病的防控提供参考。
材料与方法
1．1 动物、菌株与培养条件
本实验所用CD1小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，SS9病猪分离株GZ0565由本实验室分离鉴定并保存，SS9LysM重组蛋白表达载体BL21pSET32aLysm为本实验初期构建所得。SS菌株均用THB液体和THA平板（THB加1.5%琼脂粉）培养，37℃，SS复壮使用6%绵羊血平板，37℃。大肠杆菌菌株培养于LB（Becton Dickinson）液体或平板，37℃。必要时在培养基中添加一定浓度的抗生素：对于大肠杆菌，氨苄青霉素，100μg/mL。
1．2 试剂与仪器
核酸Marker购自OMEGA BioTek公司；无菌绵羊血购自江苏省疾控中心；BL21（DE3）大肠杆菌感受态细胞及蛋白BCA定量试剂盒购自南京天为生物科技公司；氨苄青霉素购自上海英骏生物公司；HisTrap HP镍柱为GE公司产品；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠抗体购自北京鼎国昌盛公司；显色剂TMB购自北京天根生化科技有限公司；2×Taq Master Mix购自南京诺唯赞生物科技公司；PCR高保真Mix及胶回收试剂盒购自大连TaKaRa生物工程公司。铁离子浓度检测试剂盒购自BioAssay；其他试剂均为进口或国产分析纯；引物合成由北京鼎国昌盛公司完成；测序由上海桑尼生物科技公司完成；培养基由本实验室配制。
PCR仪和凝胶成像系统为美国伯乐（BIORAD）公司产品；超声波破碎仪为浙江宁波新芝生物科技公司产品；大型台式冷冻离心机为贝克曼库尔特商贸有限公司（Beckman coulter）产品；离心机、测量DNA浓度及纯度的仪器Nanodrop 2000均为Thermo公司产品；酶标仪为OMEGA Bio Tek公司产品。
1．3 方法
1.3.1 LysM序列在猪链球菌中同源性分析
1.3.1.1 获得各菌种氨基酸序列
目前NCBI已公布20株猪链球菌全基因组测序结果，对于这些菌株通过NCBI BLAST，以SS9LysM氨基酸序列为模板查找其LysM氨基酸序列；未全基因测序菌株用SS9LysM基因上下游引物（见表1）LysMA、LysMD通过PCR扩增LysM基因片段，包括毒力株：HA9801、ZY05719、HA0608；无毒株：SH040917、05HAS68。扩增体系为PrimeSTAR Premix 25μL，引物LysMA、LysMD各2.5μL，模板1μL，ddH2O 19μL。扩增条件为98℃ 10s，55℃ 15s，72℃ 3min，30个循环；72℃延伸10min。将各目的片段PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切下目的片段，用TaKaRa胶回收试剂盒回收目的片段，并送至上海桑尼公司测序，将所得核酸序列通过ORF Finder获得其氨基酸序列。
表1 SS9LysM基因上下游引物序列
引物名称
引物序列
LysMA
AAATTAGCTCCGACAGGTGT
LysMD
GATAGAAGGTAAAGATTGGGCC
1.3.1.2 同源性比对、分析
将SS9LysM氨基酸序列分别与各菌株氨基酸序列在EMBLEBI中利用Needle进行同源性比对，得到两蛋白氨基酸序列的同源性数据并进行分析，利用多重序列比对软件ClustalX进行多重比对。
1.3.2 纯化SS9LysM蛋白
前期工作已构建pSET32aLysM重组质粒，并将其转化入大肠杆菌感受态BL21。将pET32aLysMBL21菌液以1:100的比例接种于LB（含100μg/mL Amp）液体培养基内，37℃，180rpm培养约3h，当菌液浓度达OD600为0.4~0.6时，加入异丙基βD半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.1mmol/L。37℃180rpm继续振摇培养4h后9200rpm，4℃离心5min，并用溶解buffer洗3次。溶解buffer重悬后菌体加入PMSF至终浓度为1mg/mL。用超声破碎仪破碎菌体，超声破碎仪工作状态为400W，工作5S，间隔5S，工作80次。超声破碎后离心弃去细胞碎片，取上清，将含重组蛋白的上清液用0.4μm滤膜过滤。

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