均一性黄芪中性多糖的提取纯化及硒化修饰的研究
均一性黄芪中性多糖的提取纯化及硒化修饰的研究[20200507191851]
摘要：【目的】将黄芪饮片提取纯化后得到的均一性中性黄芪多糖（Astragalus polysaccharides，APS）进行硒化修饰，寻找最佳硒化条件，为进一步深入研究硒化对黄芪多糖活性的影响提供基础。【方法】采用水提醇沉法提取黄芪中性粗多糖，三氯乙酸法及DEAE柱层析法得到均一性多糖，然后采用硝酸-亚硒酸钠法依据L9(34)正交试验进行硒化修饰，选择亚硒酸钠含量（A）、反应温度（B）和反应时间（C）三个因素，取3个水平（A为200 mg、300 mg、400 mg，B为50 ℃、70 ℃、90 ℃，C为6 h、8 h、10 h）得到9中硒化产物。【结果】硒化修饰后产物量较大的组合分别是A1B3C3和A2B3C1，均为170 mg，最高富硒含量的组合是A1B3C3和A2B3C1，分别为4.45 mg/g和4.46 mg/g。【结论】结果表明，黄芪多糖经去蛋白和过柱后纯化效果良好，且被成功硒化修饰，得到的硒化条件组合为进一步修饰研究提供了理论依据。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
关键字:黄芪多糖；提取纯化；硒化修饰；正交试验
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言 1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2 方法 2
1.2.1 黄芪多糖的提取2
1.2.2 均一性黄芪粗多糖的制备3
1.2.3 糖含量的测定3
1.2.4 多糖的冷冻干燥3
1.2.5 多糖的硒化修饰3
2 结果5
2.1 黄芪多糖提取纯化得率5
2.2 硒化黄芪多糖6
3 小结与讨论 7
3.1 黄芪多糖的提取7
3.2 黄芪多糖的去蛋白7
3.3 黄芪多糖的纯化7
3.4 黄芪多糖的硒化修饰条件优化7
3.4.1 正交试验7
3.4.2 方差分析7
3.5 黄芪多糖的其他硒化方法8
致谢8
参考文献8
图1 多糖含量的标准曲线5
图2 黄芪多糖的DEAE柱洗脱曲线（D 2 cm×50 cm）5
图3 硒含量的标准曲线6
表1 硒标准曲线的溶液配制4
表2 硒化黄芪多糖L9（34）正交试验结果6
表3 以产物量为指标的方差分析表6
表4 以硒含量为指标的方差分析表6
均一性黄芪中性多糖的提取纯化及硒化修饰的研究
引言
黄芪（Radix Astragalus）是豆科植物蒙古黄芪或膜夹黄芪的干燥根，其性甘，微温，归脾、肺经，具有补气升阳、益卫固表、利水消肿、托疮生肌之功效，可煎服、生用或蜜炙用[ *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
1]。主要化学成分为多糖、皂苷、黄酮、多种氨基酸及微量元素[2]。其中黄芪多糖（Astragalus polysaccharides，APS）为主要的有效成分，包括葡聚糖和杂多糖[3]。
随着科学的发展，人们逐步认识到一些微量元素，比如硒，是动物必需的微量元素[5]，且证实硒是人体必需的微量元素[6]，是硒蛋白的一个关键组成部分，如谷胱甘肽过氧化物酶，并在许多细胞中是一种非常重要的抗氧化剂，可增强机体免疫力、延缓衰老和预防疾病等[7,8]，且有机硒相对于无机硒更易吸收和更低毒性[9]。
研究发现，多糖的衍生物，如硫酸化黄芪多糖和硒化党参多糖，具有增强机体细胞免疫和体液免疫功能、促进细胞因子的释放、增强免疫细胞活性、提高抗体水平等活性[10]，在提高机体免疫功能、病毒防治及肿瘤治疗等当面发挥着极其重要的作用，是一种良好的免疫促进剂。硒多糖富含有机硒，比普通多糖具有更多和更强的生物活性，如抗癌、降血脂、抗氧化和抗菌等作用[11]。常见的修饰方法包括硫酸化、磷酸化、硒化、酯化、乙酰化、甲基化等。其中，多糖的硒化修饰方法有二氯氧化硒法和硝酸-亚硒酸钠法[12]，其中后者反应条件相对简单，产物获取快速、产物硒含量较高等优点较为常用[13]。为了进一步研究硒化对黄芪多糖药理活性的影响，优化硒化黄芪多糖的制备工艺，本课题拟在实验室已有的基础上，采用硝酸-亚硒酸钠法对黄芪多糖进行结构修饰，通过正交试验，对已有的制备工艺进行优化，并制备一定量的硒化黄芪多糖，为后续全面研究硒化黄芪多糖的活性提供基础。
1 材料与方法
1．1 材料
药材：黄芪（购自丰原药业，皖20100164）；
试剂：D（+）－葡萄糖，分析纯，中国惠兴生化试剂有限公司；亚硒酸钠溶液，称取亚硒酸钠（购自生工生物，2309B511）5g，加蒸馏水100 ml溶解，制成0.05 g/ml的溶液。硒标准应用液：精密吸取100 μg/ml的硒标准储备液（国家标准物质研究中心提供）1 mL，加5% 盐酸溶液10倍逐级稀释至0.01 μg/ml的溶液。乙醇、 NaOH、三氯乙酸、DEAE、NaCl、硫酸、苯酚、Na2CO3、高氯酸、无水乙醇，均为分析纯（AR）；浓硝酸、浓盐酸，均为优级纯（GR）等；
器材：三颈瓶（1000 mL）、离心管（50 mL）、烧杯、玻璃棒、层析柱、烧杯、试管（10 mL、15 mL）、胶头滴管、移液枪（1 mL、10 mL）、三角瓶（200mL）、具塞三角瓶（150 mL）、容量瓶（25 mL、50 mL、1000 mL）等；
设备：FA1104N电子天平，上海精密科学仪器有限公司；754紫外分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；真空干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；旋转蒸发仪RE－52A，上海亚荣生化仪器厂；DGG－9140A 电热恒温鼓风干燥箱，上海实验仪器有限公司；SHZ－Ⅲ型循环水真空泵，南京科尔仪器设备有限公司；透析袋，上海绿岛生物科技有限公司；离心机湘仪L－550，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；层析柱（2 cm×80 cm），上海实验仪器厂；BA－100A自动部分收集器，上海泸西分析仪器厂；DHL－B数显恒流泵，上海泸西分析仪器有限公司；冷冻干燥机Scientz－12N，宁波新芝生物科技有限公司；DEAE－52柱层析填料：whatman进口分装产 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
品；KH－500DE数控超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；HH－6恒温水浴锅，浙江金坛市新航仪器厂；SHZ－28A振荡水浴锅，江苏省太仓市华美生化仪器厂；AFS－8X原子荧光光度计（北京吉天仪器有限公司）等。
1．2 方法
1．2．1 黄芪多糖的提取
取黄芪饮片约500 g，用600 mL 95% 乙醇浸泡12 h，加热回流3次，每次2 h，药渣在37 ℃烘箱内烘干。药渣加入10倍水煎煮1次，8倍水煎煮2次，每次均2 h，四层纱布滤过，合并滤液，浓缩至400 mL。向浓缩液中缓慢加入95%乙醇，边加边搅拌，使醇含量达到80%，室温静置过夜，抽滤，滤饼于50℃烘箱内烘干，得到粗黄芪多糖，称重并计算提取率，计算公式如下。
多糖质量（g）
黄芪饮片质量（g）
多糖提取率（%）=
1．2．2 均一性黄芪多糖的制备
1．2．2．1 粗多糖去蛋白
将黄芪多糖溶解于10倍蒸馏水中，60 ℃水浴30 min，并超声裂解10 min使其溶解完全。配制1% NaOH溶液，将多糖溶液pH值调至中性，再加入3% 三氯乙酸溶液，使CCl3COOH占总溶液的7.5%。4 ℃冰箱静置24 h，3500 rpm离心15 min，收集上清液重复操作2次，弃去沉淀。
1．2．2．2 粗多糖柱层析分离
S1 0.5 1.00
S2 1.0 2.00
S3 2.0 4.00
S4 4.0 8.00
S5 5.0 10.00
还原剂：即硼氢化钾溶液，以氢氧化钾为稳定介质，防止其分解。将0.5% 浓度（W/V）KOH用去离子水完全溶解后加入1.5% 浓度（W/V）KBH4中，溶解后摇匀（现用现配为宜，配置顺序不可颠倒）。
载流相：与标液基体相一致的等浓度酸溶液，即5% HCl（V/V），量取50 mL浓盐酸（优级纯），用去离子水定容至1000 mL。
摘要：【目的】将黄芪饮片提取纯化后得到的均一性中性黄芪多糖（Astragalus polysaccharides，APS）进行硒化修饰，寻找最佳硒化条件，为进一步深入研究硒化对黄芪多糖活性的影响提供基础。【方法】采用水提醇沉法提取黄芪中性粗多糖，三氯乙酸法及DEAE柱层析法得到均一性多糖，然后采用硝酸-亚硒酸钠法依据L9(34)正交试验进行硒化修饰，选择亚硒酸钠含量（A）、反应温度（B）和反应时间（C）三个因素，取3个水平（A为200 mg、300 mg、400 mg，B为50 ℃、70 ℃、90 ℃，C为6 h、8 h、10 h）得到9中硒化产物。【结果】硒化修饰后产物量较大的组合分别是A1B3C3和A2B3C1，均为170 mg，最高富硒含量的组合是A1B3C3和A2B3C1，分别为4.45 mg/g和4.46 mg/g。【结论】结果表明，黄芪多糖经去蛋白和过柱后纯化效果良好，且被成功硒化修饰，得到的硒化条件组合为进一步修饰研究提供了理论依据。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
关键字:黄芪多糖；提取纯化；硒化修饰；正交试验
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言 1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2 方法 2
1.2.1 黄芪多糖的提取2
1.2.2 均一性黄芪粗多糖的制备3
1.2.3 糖含量的测定3
1.2.4 多糖的冷冻干燥3
1.2.5 多糖的硒化修饰3
2 结果5
2.1 黄芪多糖提取纯化得率5
2.2 硒化黄芪多糖6
3 小结与讨论 7
3.1 黄芪多糖的提取7
3.2 黄芪多糖的去蛋白7
3.3 黄芪多糖的纯化7
3.4 黄芪多糖的硒化修饰条件优化7
3.4.1 正交试验7
3.4.2 方差分析7
3.5 黄芪多糖的其他硒化方法8
致谢8
参考文献8
图1 多糖含量的标准曲线5
图2 黄芪多糖的DEAE柱洗脱曲线（D 2 cm×50 cm）5
图3 硒含量的标准曲线6
表1 硒标准曲线的溶液配制4
表2 硒化黄芪多糖L9（34）正交试验结果6
表3 以产物量为指标的方差分析表6
表4 以硒含量为指标的方差分析表6
均一性黄芪中性多糖的提取纯化及硒化修饰的研究
引言
黄芪（Radix Astragalus）是豆科植物蒙古黄芪或膜夹黄芪的干燥根，其性甘，微温，归脾、肺经，具有补气升阳、益卫固表、利水消肿、托疮生肌之功效，可煎服、生用或蜜炙用[ *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
1]。主要化学成分为多糖、皂苷、黄酮、多种氨基酸及微量元素[2]。其中黄芪多糖（Astragalus polysaccharides，APS）为主要的有效成分，包括葡聚糖和杂多糖[3]。
随着科学的发展，人们逐步认识到一些微量元素，比如硒，是动物必需的微量元素[5]，且证实硒是人体必需的微量元素[6]，是硒蛋白的一个关键组成部分，如谷胱甘肽过氧化物酶，并在许多细胞中是一种非常重要的抗氧化剂，可增强机体免疫力、延缓衰老和预防疾病等[7,8]，且有机硒相对于无机硒更易吸收和更低毒性[9]。
研究发现，多糖的衍生物，如硫酸化黄芪多糖和硒化党参多糖，具有增强机体细胞免疫和体液免疫功能、促进细胞因子的释放、增强免疫细胞活性、提高抗体水平等活性[10]，在提高机体免疫功能、病毒防治及肿瘤治疗等当面发挥着极其重要的作用，是一种良好的免疫促进剂。硒多糖富含有机硒，比普通多糖具有更多和更强的生物活性，如抗癌、降血脂、抗氧化和抗菌等作用[11]。常见的修饰方法包括硫酸化、磷酸化、硒化、酯化、乙酰化、甲基化等。其中，多糖的硒化修饰方法有二氯氧化硒法和硝酸-亚硒酸钠法[12]，其中后者反应条件相对简单，产物获取快速、产物硒含量较高等优点较为常用[13]。为了进一步研究硒化对黄芪多糖药理活性的影响，优化硒化黄芪多糖的制备工艺，本课题拟在实验室已有的基础上，采用硝酸-亚硒酸钠法对黄芪多糖进行结构修饰，通过正交试验，对已有的制备工艺进行优化，并制备一定量的硒化黄芪多糖，为后续全面研究硒化黄芪多糖的活性提供基础。
1 材料与方法
1．1 材料
药材：黄芪（购自丰原药业，皖20100164）；
试剂：D（+）－葡萄糖，分析纯，中国惠兴生化试剂有限公司；亚硒酸钠溶液，称取亚硒酸钠（购自生工生物，2309B511）5g，加蒸馏水100 ml溶解，制成0.05 g/ml的溶液。硒标准应用液：精密吸取100 μg/ml的硒标准储备液（国家标准物质研究中心提供）1 mL，加5% 盐酸溶液10倍逐级稀释至0.01 μg/ml的溶液。乙醇、 NaOH、三氯乙酸、DEAE、NaCl、硫酸、苯酚、Na2CO3、高氯酸、无水乙醇，均为分析纯（AR）；浓硝酸、浓盐酸，均为优级纯（GR）等；
器材：三颈瓶（1000 mL）、离心管（50 mL）、烧杯、玻璃棒、层析柱、烧杯、试管（10 mL、15 mL）、胶头滴管、移液枪（1 mL、10 mL）、三角瓶（200mL）、具塞三角瓶（150 mL）、容量瓶（25 mL、50 mL、1000 mL）等；
设备：FA1104N电子天平，上海精密科学仪器有限公司；754紫外分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；真空干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；旋转蒸发仪RE－52A，上海亚荣生化仪器厂；DGG－9140A 电热恒温鼓风干燥箱，上海实验仪器有限公司；SHZ－Ⅲ型循环水真空泵，南京科尔仪器设备有限公司；透析袋，上海绿岛生物科技有限公司；离心机湘仪L－550，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；层析柱（2 cm×80 cm），上海实验仪器厂；BA－100A自动部分收集器，上海泸西分析仪器厂；DHL－B数显恒流泵，上海泸西分析仪器有限公司；冷冻干燥机Scientz－12N，宁波新芝生物科技有限公司；DEAE－52柱层析填料：whatman进口分装产 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
品；KH－500DE数控超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；HH－6恒温水浴锅，浙江金坛市新航仪器厂；SHZ－28A振荡水浴锅，江苏省太仓市华美生化仪器厂；AFS－8X原子荧光光度计（北京吉天仪器有限公司）等。
1．2 方法
1．2．1 黄芪多糖的提取
取黄芪饮片约500 g，用600 mL 95% 乙醇浸泡12 h，加热回流3次，每次2 h，药渣在37 ℃烘箱内烘干。药渣加入10倍水煎煮1次，8倍水煎煮2次，每次均2 h，四层纱布滤过，合并滤液，浓缩至400 mL。向浓缩液中缓慢加入95%乙醇，边加边搅拌，使醇含量达到80%，室温静置过夜，抽滤，滤饼于50℃烘箱内烘干，得到粗黄芪多糖，称重并计算提取率，计算公式如下。
多糖质量（g）
黄芪饮片质量（g）
多糖提取率（%）=
1．2．2 均一性黄芪多糖的制备
1．2．2．1 粗多糖去蛋白
将黄芪多糖溶解于10倍蒸馏水中，60 ℃水浴30 min，并超声裂解10 min使其溶解完全。配制1% NaOH溶液，将多糖溶液pH值调至中性，再加入3% 三氯乙酸溶液，使CCl3COOH占总溶液的7.5%。4 ℃冰箱静置24 h，3500 rpm离心15 min，收集上清液重复操作2次，弃去沉淀。
1．2．2．2 粗多糖柱层析分离
S1 0.5 1.00
S2 1.0 2.00
S3 2.0 4.00
S4 4.0 8.00
S5 5.0 10.00
还原剂：即硼氢化钾溶液，以氢氧化钾为稳定介质，防止其分解。将0.5% 浓度（W/V）KOH用去离子水完全溶解后加入1.5% 浓度（W/V）KBH4中，溶解后摇匀（现用现配为宜，配置顺序不可颠倒）。
载流相：与标液基体相一致的等浓度酸溶液，即5% HCl（V/V），量取50 mL浓盐酸（优级纯），用去离子水定容至1000 mL。
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