prrs病毒n蛋白的截短表达与鉴定
根据PRRS病毒N蛋白的结构与功能，本试验共设计了5个截短蛋白，依次设计引物，采用PCR方法扩增截短蛋白基因，进而将截短蛋白基因与真核表达载体pCMV-HA酶切与连接构建重组质粒；将重组质粒转染HEK 293细胞，以Western-blotting及间接免荧光试验（IFA）分析截短蛋白的表达情况。试验结果显示5个重组质粒均构建成功，5个截短蛋白均表达成功，为进一步研究其功能奠定了基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料2
1.2 方法4
1.2.1 PRRS病毒JXwn06 毒株 ORF7 截短基因片段的克隆 4
1.2.1.1序列分析4
1.2.1.2引物设计4
1.2.1.3 PCR 4
1.2.1.4 目的基因PCR 产物的鉴定与回收5
1.2.2 真核表达质粒的构建5
1.2.2.1目的基因与表达载体质粒pCMVHA的酶切 5
1.2.2.2目的基因与表达载体质粒pCMVHA的连接 5
1.2.2.3转化 6
1.2.2.4重组质粒的鉴定6
1.2.2.5重组质粒的中提6
1.2.3 HEK 293细胞的传代7
1.2.4 转染7
1.2.5 Westernblotting 8
1.2.6 间接免疫荧光试验（IFA）8
2 结果与分析9
2.1 PRRS病毒JXwn06 毒株 ORF7 的序列分析 9
2.2 PRRS病毒JXwn06 毒株 ORF7截短基因片段的克隆与真核表达质粒的构建 9
2.2.1目的基因的扩增 9
2.2.2目的基因及载体质粒pCMVHA的酶切鉴定 9
2.2.3重组质粒的PCR鉴定 10
2.2.4序列鉴定 11
2.3 Westernblotting 鉴定 12
2.4免疫荧光鉴定13< *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
br /> 3 讨论15
致谢16
参考文献17
附录17
PRRS 病毒N 蛋白的截短表达与鉴定
动物医学院 李倩琳
引言
猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）是上个世纪80年代末出现的一种危害世界养猪业的病毒性传染病，主要引起母猪的繁殖障碍和其它各年龄猪的呼吸道症状以及仔猪的高死亡率，俗称“蓝耳病”。
该病的病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV），归属于动脉炎病毒科，套式病毒目[1]（其典型特征是在其复制酶基因下游可转录出一套含有共同3’末端的亚基因组mRNA）。PRRSV 可分为北美型（II 型）和欧洲型（I 型），两基因型间在核苷酸水平只有约 60%的相似性[2]。
PRRSV的基因组为单股正链RNA，可编码7种结构蛋白。其中研究较多的是核衣壳蛋白（nucleocapsid protein，N蛋白）。N蛋白是由 ORF7 编码，从最小的亚基因组 7（mRNA7）翻译出的结构蛋白。它是病毒感染细胞中表达量最高的蛋白[3]，保守性强。N蛋白是非糖基化的蛋白，在北美型（II 型）和欧洲型（I 型）分别有123和128个氨基酸，分子量大小约 15kD。N蛋白上含有核酸定位序列(NLS)及与RNA结合的结构域，与病毒的复制过程密切相关[4]。
关于N 蛋白的结构，总体可以划分为 N 端的 RNA 结合域和 C 端的二聚体形成区域。N 端的1～57位氨基酸被认为是非常无序的而且含有很多极性氨基酸，这与RNA结合特性一致[5]。PRRSV毒株之间以及与动脉炎病毒科其它成员间的最大区别就在于此区域，也可能是因为这个区域比较松散的缘故[6]。N蛋白的C端区域比较保守，可以形成稳定的二聚体结构。
PRRSV 和一些其它的 RNA 病毒一样在细胞质内复制。但是，一部分 N 蛋白可以进入到如猪肺泡巨噬细胞（porcine alveolar macrophages，PAM） 和 MARC145 细胞的细胞核和核仁[7]。有研究表明 N 蛋白入核可能与病毒的致病性有关[4]。N 蛋白自身存在自我互作的特性,这一特性可能也是 PRRSV 核衣壳组装的基础。尽管已经证实 N 蛋白与核仁小 RNA 相关核纤维蛋白有互作，但是 N 蛋白的具体转运入核机制并不清楚[5]。
本试验从N蛋白的结构与功能出发，设计截短蛋白并对其进行真核表达鉴定。试验中共设计了5个截短蛋白，主要以引物设计，截短蛋白基因的扩增，截短基因与真核表达载体pCMVHA的酶切与连接等方法构建重组质粒。将重组质粒转染HEK 293细胞，以Westernblotting及间接免荧光试验（IFA）分析截短蛋白的表达情况。本试验中所构建的质粒可广泛应用于PRRS病毒N蛋白与宿主蛋白互作区域的研究及其他相关研究。本试验的结果可为进一步研究 N 蛋白的结构与功能关系提供一定参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 血清,抗体及载体
牛血清白蛋白（bovein serum album, BSA）: 购自New England Biolabs公司
小鼠抗HA单克隆抗体：购自Sigma公司
山羊抗小鼠IgG(HRP标记), 山羊抗小鼠IgG（FITC标记）：购自中杉金桥公司
克隆载体pCMVHA : 由农业部动物流行病学与人畜共患病国家重点实验室猪病研究室保存。
1.1.2 主要试剂
1.1.2.1 PCR试剂：
Trans 2K Maker:购自北京全式金生物技术有限公司
10× Loading Buffer:购自TaKaBa公司
KOD 酶，KOD Buffer ，dNTPs : 购自东洋纺（TOYOBO）公司
Nuclease Free water: 购自Promega公司
1.1.2.2 酶切与连接试剂：
T4 DNA 连接酶，限制性内切酶EcoRⅠ和KpnⅠ: 购自New England Biolabs公司
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料2
1.2 方法4
1.2.1 PRRS病毒JXwn06 毒株 ORF7 截短基因片段的克隆 4
1.2.1.1序列分析4
1.2.1.2引物设计4
1.2.1.3 PCR 4
1.2.1.4 目的基因PCR 产物的鉴定与回收5
1.2.2 真核表达质粒的构建5
1.2.2.1目的基因与表达载体质粒pCMVHA的酶切 5
1.2.2.2目的基因与表达载体质粒pCMVHA的连接 5
1.2.2.3转化 6
1.2.2.4重组质粒的鉴定6
1.2.2.5重组质粒的中提6
1.2.3 HEK 293细胞的传代7
1.2.4 转染7
1.2.5 Westernblotting 8
1.2.6 间接免疫荧光试验（IFA）8
2 结果与分析9
2.1 PRRS病毒JXwn06 毒株 ORF7 的序列分析 9
2.2 PRRS病毒JXwn06 毒株 ORF7截短基因片段的克隆与真核表达质粒的构建 9
2.2.1目的基因的扩增 9
2.2.2目的基因及载体质粒pCMVHA的酶切鉴定 9
2.2.3重组质粒的PCR鉴定 10
2.2.4序列鉴定 11
2.3 Westernblotting 鉴定 12
2.4免疫荧光鉴定13< *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
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致谢16
参考文献17
附录17
PRRS 病毒N 蛋白的截短表达与鉴定
动物医学院 李倩琳
引言
猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）是上个世纪80年代末出现的一种危害世界养猪业的病毒性传染病，主要引起母猪的繁殖障碍和其它各年龄猪的呼吸道症状以及仔猪的高死亡率，俗称“蓝耳病”。
该病的病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV），归属于动脉炎病毒科，套式病毒目[1]（其典型特征是在其复制酶基因下游可转录出一套含有共同3’末端的亚基因组mRNA）。PRRSV 可分为北美型（II 型）和欧洲型（I 型），两基因型间在核苷酸水平只有约 60%的相似性[2]。
PRRSV的基因组为单股正链RNA，可编码7种结构蛋白。其中研究较多的是核衣壳蛋白（nucleocapsid protein，N蛋白）。N蛋白是由 ORF7 编码，从最小的亚基因组 7（mRNA7）翻译出的结构蛋白。它是病毒感染细胞中表达量最高的蛋白[3]，保守性强。N蛋白是非糖基化的蛋白，在北美型（II 型）和欧洲型（I 型）分别有123和128个氨基酸，分子量大小约 15kD。N蛋白上含有核酸定位序列(NLS)及与RNA结合的结构域，与病毒的复制过程密切相关[4]。
关于N 蛋白的结构，总体可以划分为 N 端的 RNA 结合域和 C 端的二聚体形成区域。N 端的1～57位氨基酸被认为是非常无序的而且含有很多极性氨基酸，这与RNA结合特性一致[5]。PRRSV毒株之间以及与动脉炎病毒科其它成员间的最大区别就在于此区域，也可能是因为这个区域比较松散的缘故[6]。N蛋白的C端区域比较保守，可以形成稳定的二聚体结构。
PRRSV 和一些其它的 RNA 病毒一样在细胞质内复制。但是，一部分 N 蛋白可以进入到如猪肺泡巨噬细胞（porcine alveolar macrophages，PAM） 和 MARC145 细胞的细胞核和核仁[7]。有研究表明 N 蛋白入核可能与病毒的致病性有关[4]。N 蛋白自身存在自我互作的特性,这一特性可能也是 PRRSV 核衣壳组装的基础。尽管已经证实 N 蛋白与核仁小 RNA 相关核纤维蛋白有互作，但是 N 蛋白的具体转运入核机制并不清楚[5]。
本试验从N蛋白的结构与功能出发，设计截短蛋白并对其进行真核表达鉴定。试验中共设计了5个截短蛋白，主要以引物设计，截短蛋白基因的扩增，截短基因与真核表达载体pCMVHA的酶切与连接等方法构建重组质粒。将重组质粒转染HEK 293细胞，以Westernblotting及间接免荧光试验（IFA）分析截短蛋白的表达情况。本试验中所构建的质粒可广泛应用于PRRS病毒N蛋白与宿主蛋白互作区域的研究及其他相关研究。本试验的结果可为进一步研究 N 蛋白的结构与功能关系提供一定参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 血清,抗体及载体
牛血清白蛋白（bovein serum album, BSA）: 购自New England Biolabs公司
小鼠抗HA单克隆抗体：购自Sigma公司
山羊抗小鼠IgG(HRP标记), 山羊抗小鼠IgG（FITC标记）：购自中杉金桥公司
克隆载体pCMVHA : 由农业部动物流行病学与人畜共患病国家重点实验室猪病研究室保存。
1.1.2 主要试剂
1.1.2.1 PCR试剂：
Trans 2K Maker:购自北京全式金生物技术有限公司
10× Loading Buffer:购自TaKaBa公司
KOD 酶，KOD Buffer ，dNTPs : 购自东洋纺（TOYOBO）公司
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T4 DNA 连接酶，限制性内切酶EcoRⅠ和KpnⅠ: 购自New England Biolabs公司
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