母鸡饲喂甜菜碱缓解子代肝脏胆固醇代谢紊乱的表遗传机制研究
：甜菜碱作为甲基供体，能够改善机体代谢和缓解应激，母体饲喂甜菜碱还可以通过表遗传影响子代的脂质代谢。在现代化养禽业中，应激导致肝脏胆固醇代谢紊乱常常伴随着慢性代谢性疾病的发生，严重影响肉品质和生产性能。但是母体饲喂甜菜碱能否通过表遗传缓解应激造成的肝脏胆固醇代谢异常未见报道。本实验以如皋黄鸡为实验对象，在种母鸡日粮中添加0.5%的甜菜碱研究母体效应对应激情况下子代肝脏胆固醇代谢的影响。本实验发现母体饲喂甜菜碱可显著降低子代雄鸡肝脏中总胆固醇的含量，胆固醇的合成基因HMGCR和摄取基因LDLR在子代肝脏中显著下调（P < 0.05）。在注射皮质酮后，LDLR基因显著升高（P < 0.05），而胆固醇降解经典通路中的关键酶 CYP7α1蛋白表达显著下调（P < 0.05），其中甜菜碱能够发挥母体效应校正前者的表达水平。同时，母体饲喂甜菜碱显著上调了子代雄鸡肝脏中BHMT、AHCYL1和MAT2B的蛋白含量（P < 0.05），并缓解了注射皮质酮引起的BHMT蛋白表达量的降低和MAT2B、AHCYL1的蛋白含量的升高（P < 0.05），维持了机体的甲基化水平。以上结果说明，如皋黄鸡母鸡产蛋期饲喂甜菜碱可显著缓解子代雄鸡应激后肝脏胆固醇的累积，并伴随肝脏胆固醇摄取基因LDLR和脂解基因CYP7α1的变化，提示母鸡产蛋期饲喂的甜菜碱通过调控相关功能基因的表达，影响子代肝脏胆固醇代谢。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1试验动物处理及样品采集2
1.2主要试剂和仪器 2
1.3主要溶液 2
1.4方法3
1.4.1肝脏组织总胆固醇的测定3
1.4.2肝脏组织总RNA提取3
1.4.3反转录3
1.4.4引物设计3
1.4.5蛋白质免疫印迹4
1. 5数据分析及统计4
2结果与分析5
2.1子代雄性黄鸡表观指标及肝脏总胆固醇含量5
2.2子代雄鸡肝脏蛋氨酸循环相关蛋白含量5
2.3肝脏胆固醇代谢相关基因mRNA6
2.
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
4母体饲喂甜菜碱对子代雄鸡肝脏LDLR、CYP27a1和CYP27a1蛋白含量的影响6
3讨论 7
3.1母体饲喂甜菜碱维持了应激后机体的甲基化水平7
3.2甜菜碱对应激后肝脏胆固醇代谢的影响7
3.2.1甜菜碱对应激后肝脏胆固醇合成的影响7
3.2.2甜菜碱对应激后肝脏摄取胆固醇的影响8
3.2.3甜菜碱对应激后肝脏胆固醇分泌或转化影响8
致谢8
参考文献9 母鸡饲喂甜菜碱缓解子代肝脏胆固醇代谢紊乱的表遗传机制研究
引言
1942年，Waddington首次提出表观遗传的概念，经过几十年的发展已经成为系统的遗传理论。表观遗传（Epigenetics）是指在DNA序列不发生改变的情况下，细胞内非遗传信息的遗传物质发生的可遗传的改变，而且这种改变在个体发育和细胞增殖过程中能够稳定传递。美国有一句著名的谚语，“人如其食（You are what you eat）”，从表观遗传学的角度解释，意思是母体在妊娠的不同时期，其营养水平会改变胚胎的内分泌环境，并对子代的外貌特征、生理性状和行为等造成一定的影响，学术上称其为母体效应（Maternal effect）[1]。母体效应是表遗传现象之一，DNA与组蛋白的甲基化是重要的表遗传修饰[2]，甜菜碱作为甲基供体[3, 4]，极有可能发挥调节作用。胡云等[5]通过蛋内注射模拟母体效应的试验发现，蛋内沉积的甜菜碱能够降低雏鸡肝脏中的胆固醇，这一发现提示甜菜碱能够发挥一定的母体效应并具有重要的生产意义。
家禽养殖过程中常常由高温、拥挤、运输、人员流动等因素引起鸡群应激，给养禽业带来巨大损失[6]。在禽类，应激会导致下丘脑垂体肾上腺皮质轴激活，ACTH和皮质酮分泌增加，其意义在于从多方面调整机体对应激刺激的适应力和抵御能力，从而保护自身。但近年来研究发现，过量皮质酮会导致肝脏胆固醇代谢异常的发生。肉鸡肝脏中沉积过多的胆固醇不仅会引起代谢性疾病，也会危害消费者的健康[7]。
虽然母体营养已经被发现对子代胆固醇代谢的影响，如大鼠母体蛋白限饲后，能够降低子代血清胆固醇含量[8]，但是母体甲基供体对子代胆固醇的影响鲜有报道，机制更不明确。因此，本研究以如皋黄鸡作为动物模型，以注射皮质酮模拟应激，研究甜菜碱的母体效应对子代雄鸡肝脏胆固醇代谢的影响。我们检测了子代雄鸡肝脏胆固醇的含量以及在分子水平检测与胆固醇代谢相关的基因的表达。本文通过阐述产蛋期母鸡日粮添加甜菜碱对子代雄鸡应激后肝脏胆固醇代谢的影响，并探讨其表遗传调控机制，为畜禽健康生长以及疾病防治提供重要的理论依据。
1 材料与方法
1．1 试验动物处理及样品采集
选用120只产蛋高峰期如皋黄鸡，均重1.40 kg，随机分为正常日粮组（C）和甜菜碱组（B）。在产蛋期对前者饲喂正常日粮，后者饲喂等能量且含0.5% 甜菜碱的日粮，饲喂28天后，各组同时收集大小相近的200个受精蛋，孵化21天，并饲养至49日龄。正常日粮组和甜菜碱组各挑选体重相近的子代雄鸡各30只，随机分为正常日粮对照组（Ccon）和正常日粮皮质酮组（Ccort），甜菜碱对照组（Bcon）和甜菜碱皮质酮组（Bcort）。皮质酮组均注射4 mg/kg 的皮质酮，对照组均注射等体积的酒精生理盐水。连续注射7天，每天记录采食量。饲养至56天称重，采血并称取肝重，采集肝脏分子样冻存于 80 ℃。
1．2 主要试剂和仪器
组织总胆固醇测定试剂盒（E1015，北京普利莱基因技术有限公司，线性范围20~5000 μmol/L）；BCA总蛋白测定试剂盒（Prod#23227 PierceTM BCA protein Assay Kit.Thermo）和ECL化学放光试剂盒（Pierce Super Signal West Pico Trial Kit，购自南京生兴生物工程有限公司）；Trizol试剂盒（英骏生物工程有限公司，上海）；反转录试剂盒（R12301）和荧光酶（Q11102）购于南京诺唯赞生物科技有限公司；RNA酶抑制剂（Roche Complete EDTA free RNAase inhibitor）购于罗氏公司。
PCR仪（BioRad DNA Engine Peltier Thermol Cycler PTC0200,BioRad，USA）；实时荧光定量PCR仪（Mx3000P，Stratagene，USA）；电泳仪（BioRad，USA）；转印仪（BioRad，USA）；酶标仪（Synergy，BioTek，USA）；96孔酶标板；核酸定量仪（Nanodrop ND1000）；离心机（Optima L80XP，Beckman，USA）；生化分析仪（7200，HITACH，JAPAN）；珠式细胞破碎仪（Micro SmashTM MS100R，TOMY）。
1．3 主要溶液
RNA变性液：2 μL 10 × MOPS溶液：3.6 μL甲醛，10 μL去离子甲酰胺。
总蛋白质裂解液：（RIPA buffer）：10 mM氯化钾，1.5 mM氯化镁，10 mM Hepes（pH = 7.9），1 mM MDTT，1 mM leupeptin，1 mM phenylmethylsulfony fluoride以及1 × Protease inhibitor Cocktail蛋白酶抑制剂。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1试验动物处理及样品采集2
1.2主要试剂和仪器 2
1.3主要溶液 2
1.4方法3
1.4.1肝脏组织总胆固醇的测定3
1.4.2肝脏组织总RNA提取3
1.4.3反转录3
1.4.4引物设计3
1.4.5蛋白质免疫印迹4
1. 5数据分析及统计4
2结果与分析5
2.1子代雄性黄鸡表观指标及肝脏总胆固醇含量5
2.2子代雄鸡肝脏蛋氨酸循环相关蛋白含量5
2.3肝脏胆固醇代谢相关基因mRNA6
2.
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
4母体饲喂甜菜碱对子代雄鸡肝脏LDLR、CYP27a1和CYP27a1蛋白含量的影响6
3讨论 7
3.1母体饲喂甜菜碱维持了应激后机体的甲基化水平7
3.2甜菜碱对应激后肝脏胆固醇代谢的影响7
3.2.1甜菜碱对应激后肝脏胆固醇合成的影响7
3.2.2甜菜碱对应激后肝脏摄取胆固醇的影响8
3.2.3甜菜碱对应激后肝脏胆固醇分泌或转化影响8
致谢8
参考文献9 母鸡饲喂甜菜碱缓解子代肝脏胆固醇代谢紊乱的表遗传机制研究
引言
1942年，Waddington首次提出表观遗传的概念，经过几十年的发展已经成为系统的遗传理论。表观遗传（Epigenetics）是指在DNA序列不发生改变的情况下，细胞内非遗传信息的遗传物质发生的可遗传的改变，而且这种改变在个体发育和细胞增殖过程中能够稳定传递。美国有一句著名的谚语，“人如其食（You are what you eat）”，从表观遗传学的角度解释，意思是母体在妊娠的不同时期，其营养水平会改变胚胎的内分泌环境，并对子代的外貌特征、生理性状和行为等造成一定的影响，学术上称其为母体效应（Maternal effect）[1]。母体效应是表遗传现象之一，DNA与组蛋白的甲基化是重要的表遗传修饰[2]，甜菜碱作为甲基供体[3, 4]，极有可能发挥调节作用。胡云等[5]通过蛋内注射模拟母体效应的试验发现，蛋内沉积的甜菜碱能够降低雏鸡肝脏中的胆固醇，这一发现提示甜菜碱能够发挥一定的母体效应并具有重要的生产意义。
家禽养殖过程中常常由高温、拥挤、运输、人员流动等因素引起鸡群应激，给养禽业带来巨大损失[6]。在禽类，应激会导致下丘脑垂体肾上腺皮质轴激活，ACTH和皮质酮分泌增加，其意义在于从多方面调整机体对应激刺激的适应力和抵御能力，从而保护自身。但近年来研究发现，过量皮质酮会导致肝脏胆固醇代谢异常的发生。肉鸡肝脏中沉积过多的胆固醇不仅会引起代谢性疾病，也会危害消费者的健康[7]。
虽然母体营养已经被发现对子代胆固醇代谢的影响，如大鼠母体蛋白限饲后，能够降低子代血清胆固醇含量[8]，但是母体甲基供体对子代胆固醇的影响鲜有报道，机制更不明确。因此，本研究以如皋黄鸡作为动物模型，以注射皮质酮模拟应激，研究甜菜碱的母体效应对子代雄鸡肝脏胆固醇代谢的影响。我们检测了子代雄鸡肝脏胆固醇的含量以及在分子水平检测与胆固醇代谢相关的基因的表达。本文通过阐述产蛋期母鸡日粮添加甜菜碱对子代雄鸡应激后肝脏胆固醇代谢的影响，并探讨其表遗传调控机制，为畜禽健康生长以及疾病防治提供重要的理论依据。
1 材料与方法
1．1 试验动物处理及样品采集
选用120只产蛋高峰期如皋黄鸡，均重1.40 kg，随机分为正常日粮组（C）和甜菜碱组（B）。在产蛋期对前者饲喂正常日粮，后者饲喂等能量且含0.5% 甜菜碱的日粮，饲喂28天后，各组同时收集大小相近的200个受精蛋，孵化21天，并饲养至49日龄。正常日粮组和甜菜碱组各挑选体重相近的子代雄鸡各30只，随机分为正常日粮对照组（Ccon）和正常日粮皮质酮组（Ccort），甜菜碱对照组（Bcon）和甜菜碱皮质酮组（Bcort）。皮质酮组均注射4 mg/kg 的皮质酮，对照组均注射等体积的酒精生理盐水。连续注射7天，每天记录采食量。饲养至56天称重，采血并称取肝重，采集肝脏分子样冻存于 80 ℃。
1．2 主要试剂和仪器
组织总胆固醇测定试剂盒（E1015，北京普利莱基因技术有限公司，线性范围20~5000 μmol/L）；BCA总蛋白测定试剂盒（Prod#23227 PierceTM BCA protein Assay Kit.Thermo）和ECL化学放光试剂盒（Pierce Super Signal West Pico Trial Kit，购自南京生兴生物工程有限公司）；Trizol试剂盒（英骏生物工程有限公司，上海）；反转录试剂盒（R12301）和荧光酶（Q11102）购于南京诺唯赞生物科技有限公司；RNA酶抑制剂（Roche Complete EDTA free RNAase inhibitor）购于罗氏公司。
PCR仪（BioRad DNA Engine Peltier Thermol Cycler PTC0200,BioRad，USA）；实时荧光定量PCR仪（Mx3000P，Stratagene，USA）；电泳仪（BioRad，USA）；转印仪（BioRad，USA）；酶标仪（Synergy，BioTek，USA）；96孔酶标板；核酸定量仪（Nanodrop ND1000）；离心机（Optima L80XP，Beckman，USA）；生化分析仪（7200，HITACH，JAPAN）；珠式细胞破碎仪（Micro SmashTM MS100R，TOMY）。
1．3 主要溶液
RNA变性液：2 μL 10 × MOPS溶液：3.6 μL甲醛，10 μL去离子甲酰胺。
总蛋白质裂解液：（RIPA buffer）：10 mM氯化钾，1.5 mM氯化镁，10 mM Hepes（pH = 7.9），1 mM MDTT，1 mM leupeptin，1 mM phenylmethylsulfony fluoride以及1 × Protease inhibitor Cocktail蛋白酶抑制剂。
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