缢蛏多糖的分离纯化及其纯化组分的初步理化性质研究(附件)
目的优化缢蛏多糖最佳纯化工艺参数，对纯化组分进行理化性质的初步研究。方法以洗脱峰之间的分离程度为指标，通过动态的单因素试验筛选出DEAE阴离子纤维柱对缢蛏多糖纯化的最佳条件进行考察。采用苯酚硫酸法测定缢蛏多糖中的总糖含量，采用考马斯亮蓝法测定缢蛏多糖中蛋白质的含量，用硫酸咔唑法测定缢蛏多糖中糖醛酸的含量。结果DEAE阴离子纤维柱分离纯化多糖的最佳条件为上样量200 mg，洗脱剂浓度为0、0.4 mol/L，流速为1.1 mL/min。缢蛏多糖组分Ⅰ中的蛋白含量为2.92%、总糖含量为83.78%、糖醛酸的含量为11.21%；组分Ⅱ中蛋白含量为3.61%、总糖的含量为81.12%、糖醛酸的含量为3.45%。证明了缢蛏多糖的量个组分均不含淀粉，为非淀粉多糖。结论本实验所得的DEAE阴离子纤维素柱纯化的最佳工艺参数稳定可靠，分离效率高，具有可行性。关键词 缢蛏多糖，分离纯化，理化性质
目 录
1 引言 1
1.1 多糖分离纯化研究进展 1
1.2 多糖理化性质研究 2
2 课题研究的目的及内容 4
2.1 课题研究的目的 4
2.2 课题研究的内容 4
3 实验材料与方法 5
3.1 实验材料及仪器 5
3.2 DEAE52阴离子交换柱 6
3.3 缢蛏多糖的纯化 7
3.4 纯化组分的初步理化性质 8
4 结果与分析 10
4.1 纯化参数优化的实验结果与分析 10
4.2 蛋白质标准曲线 19
4.3 葡萄糖标准曲线 21
4.4 葡萄糖醛酸标准曲线 22
4.5 碘碘化钾颜色反应 23
结 论 24
致 谢 25
参 考 文 献 26
1 引言
缢蛏是一种从属瓣鳃纲、帘蛤目、竹蛏科的软体动物，国内盛产蛏子，南北海岸散布最广，俗称蛏（福建）、蜻（浙江）、蚬（山东、辽宁）。蛏子肉美味可口，营养丰富，具有一定的药用功效，有补虚的功能，可用于治疗产后缺乏症、发烧、口渴、湿热、腹泻、排尿不利等。[1]。< *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
br /> 多糖是由多个单糖分子缩合、失水而成，它们是一种繁杂且大量的糖物质，多糖在自然界中广泛分布，亦很重要，具备免疫调节、抗癌、抗肿瘤、降血糖等药理功效，引起了人们的广泛关注。
从近些年来的学者的研究中能了解到贝类多糖具有抗肿瘤、抗衰老、抗病毒、降血糖血脂等生物活性，然而，贝类多糖大多为粘多糖，结构十分复杂，所以多糖的分离纯化就显得很重要。因此，如何科学的、高效的将多糖的纯化是个核心的问题。
1. 1 多糖分离纯化研究进展
粗多糖中常常含有色素、蛋白质、小分子糖等杂质，需要分别去除。常用Sevage法多多糖进行蛋白质脱除，然后用无水乙醇进行脱色素，紧接着就是纯化，而多糖的纯化其实就是将含有各种多糖的粗多糖分开为各种单一的多糖，分离和纯化实质上是无法完全区分开的，在分离的同时也存在着纯化。由于多糖的溶解度、分子量等性质不相同，所以多糖纯化的方法也都不尽相同，有分布沉淀法、盐析法、制备性区域电泳法、柱层析法等。
分步沉淀法是依据不同多糖在不同浓度的低级醇或酮中拥有不同溶解度的特性，逐次按比例由小至大加入这些醇或酮(乙醇最常用)分步沉淀。这种方法适宜于各种溶解度相差较大的多糖的分离。周铭东等[2]用乙醇沉淀法从河蚌中分离纯化得到一种多糖，并对其单糖组成进行了研究。卢伟芳[3]用乙醇沉淀法分离纯化鲍鱼内脏多糖，混合多糖含量为71.9%。
盐析法是依据不同种类多糖在不同盐浓度中具备不同溶解度的特性，加入不同盐析剂使多糖逐步析出。应用最多的盐析剂为硫酸铵，其他常用盐析剂还有氯化钾、氯化钠等。张坤等[4]用硫酸铵盐析剂分离纯化四角蛤蜊多糖，当底物质量浓度为20 mg/mL，硫酸铵饱和度为60%时是最优条件，得到多糖总糖含量83%，糖转移率为58.61%。
区带电泳是指在一定的支持物上，将样品加在含有同质的均一的载体电解质的中间位置，在电场的作用下，样品中带正或负电荷的离子以不同速度分别向负或正极移动，分离成一个个彼此隔开的区带[5]。区域电泳的物理特性可分为聚丙烯酞胺凝胶电泳、醋酸纤维素薄膜电泳和纸电泳。该方法有利于分离多糖，但仅适用于实验室小应用。
柱层析法又称柱色谱法，是通过色谱柱的分离作用而达到纯化目的。柱层析主要包括:离子交换层析柱、亲和层析、凝胶柱层析、纤维素柱层析、高压液相层析。其中，离子交换柱层析适用于分离各类酸性、中性多糖和黏多糖、低分子量的氨基多糖的分离；凝胶柱层析适合分离凝胶柱层析法适用于不同分子量的多糖，即分子量差别较大的多糖，不适用于黏多糖的分离；纤维素柱层析是选用浓度由高而低的乙醇水溶液进行洗脱，从而将不同种类的多糖分离开来，即用于分离高、低浓度的乙醇溶液中的多糖；高压液相色谱法是采用高压输液泵将样品溶液泵入装有载体的层析柱中进行色谱分离的方法；亲和层析是用凝集素作为亲和色谱来分离多糖，适用于含量低、不稳定的活性物质。祝雯[6]用DEAE阴离子交换柱和Sephacryls200凝胶层析柱纯化获得高品质的河蚬多糖；范秀萍[7]用DEAE52纤维素柱纯化珠母贝氨基多糖，获得高品质的氨基多糖；张铂等[8]经过大孔吸附层析、凝胶过滤层析等方法纯化获得文蛤糖肽,并经HPLC (高效液相色谱)检测为单一对称峰；陈骏洪[9]经过DEAE52离子交换层析和SephadexG100凝胶过滤层析分离纯化，分别用0、0.5M NaCI洗脱得到两种主要组分；廖宁波[10]运用阴离子交换柱和凝胶层析柱对河蚬粗多糖进行分离纯化，得到两个组分；李孟婕[11]采用DEAE52纤维素离子交换柱层析和Sephadex G200凝胶柱纯化得到含量较高两个组分；叶琳[12]用DEAEsephacel阴离子交换柱和Sepharose 6B凝胶柱进行分离纯化，得到两个多糖组分；叶双喜[13]用DEAE52纤维柱和Sephadex G200分离纯化得到得两个多糖组分；蒋长兴[14] 采用DEAE52纤维素柱层析法和Sephdex G100凝胶柱层析分离纯化青蛤粗多糖得到三个组分；李世杰[15] 用DEAE纤维素52阴离子交换柱及Sephadex G100凝胶柱分离纯化粗多糖,得到纯化多糖组分；陈静波[16]选用琼脂糖凝胶Sepharose 4B柱层析，纯化获得两种贻贝水提的水溶性多糖。
1. 2 多糖理化性质研究
目 录
1 引言 1
1.1 多糖分离纯化研究进展 1
1.2 多糖理化性质研究 2
2 课题研究的目的及内容 4
2.1 课题研究的目的 4
2.2 课题研究的内容 4
3 实验材料与方法 5
3.1 实验材料及仪器 5
3.2 DEAE52阴离子交换柱 6
3.3 缢蛏多糖的纯化 7
3.4 纯化组分的初步理化性质 8
4 结果与分析 10
4.1 纯化参数优化的实验结果与分析 10
4.2 蛋白质标准曲线 19
4.3 葡萄糖标准曲线 21
4.4 葡萄糖醛酸标准曲线 22
4.5 碘碘化钾颜色反应 23
结 论 24
致 谢 25
参 考 文 献 26
1 引言
缢蛏是一种从属瓣鳃纲、帘蛤目、竹蛏科的软体动物，国内盛产蛏子，南北海岸散布最广，俗称蛏（福建）、蜻（浙江）、蚬（山东、辽宁）。蛏子肉美味可口，营养丰富，具有一定的药用功效，有补虚的功能，可用于治疗产后缺乏症、发烧、口渴、湿热、腹泻、排尿不利等。[1]。< *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
br /> 多糖是由多个单糖分子缩合、失水而成，它们是一种繁杂且大量的糖物质，多糖在自然界中广泛分布，亦很重要，具备免疫调节、抗癌、抗肿瘤、降血糖等药理功效，引起了人们的广泛关注。
从近些年来的学者的研究中能了解到贝类多糖具有抗肿瘤、抗衰老、抗病毒、降血糖血脂等生物活性，然而，贝类多糖大多为粘多糖，结构十分复杂，所以多糖的分离纯化就显得很重要。因此，如何科学的、高效的将多糖的纯化是个核心的问题。
1. 1 多糖分离纯化研究进展
粗多糖中常常含有色素、蛋白质、小分子糖等杂质，需要分别去除。常用Sevage法多多糖进行蛋白质脱除，然后用无水乙醇进行脱色素，紧接着就是纯化，而多糖的纯化其实就是将含有各种多糖的粗多糖分开为各种单一的多糖，分离和纯化实质上是无法完全区分开的，在分离的同时也存在着纯化。由于多糖的溶解度、分子量等性质不相同，所以多糖纯化的方法也都不尽相同，有分布沉淀法、盐析法、制备性区域电泳法、柱层析法等。
分步沉淀法是依据不同多糖在不同浓度的低级醇或酮中拥有不同溶解度的特性，逐次按比例由小至大加入这些醇或酮(乙醇最常用)分步沉淀。这种方法适宜于各种溶解度相差较大的多糖的分离。周铭东等[2]用乙醇沉淀法从河蚌中分离纯化得到一种多糖，并对其单糖组成进行了研究。卢伟芳[3]用乙醇沉淀法分离纯化鲍鱼内脏多糖，混合多糖含量为71.9%。
盐析法是依据不同种类多糖在不同盐浓度中具备不同溶解度的特性，加入不同盐析剂使多糖逐步析出。应用最多的盐析剂为硫酸铵，其他常用盐析剂还有氯化钾、氯化钠等。张坤等[4]用硫酸铵盐析剂分离纯化四角蛤蜊多糖，当底物质量浓度为20 mg/mL，硫酸铵饱和度为60%时是最优条件，得到多糖总糖含量83%，糖转移率为58.61%。
区带电泳是指在一定的支持物上，将样品加在含有同质的均一的载体电解质的中间位置，在电场的作用下，样品中带正或负电荷的离子以不同速度分别向负或正极移动，分离成一个个彼此隔开的区带[5]。区域电泳的物理特性可分为聚丙烯酞胺凝胶电泳、醋酸纤维素薄膜电泳和纸电泳。该方法有利于分离多糖，但仅适用于实验室小应用。
柱层析法又称柱色谱法，是通过色谱柱的分离作用而达到纯化目的。柱层析主要包括:离子交换层析柱、亲和层析、凝胶柱层析、纤维素柱层析、高压液相层析。其中，离子交换柱层析适用于分离各类酸性、中性多糖和黏多糖、低分子量的氨基多糖的分离；凝胶柱层析适合分离凝胶柱层析法适用于不同分子量的多糖，即分子量差别较大的多糖，不适用于黏多糖的分离；纤维素柱层析是选用浓度由高而低的乙醇水溶液进行洗脱，从而将不同种类的多糖分离开来，即用于分离高、低浓度的乙醇溶液中的多糖；高压液相色谱法是采用高压输液泵将样品溶液泵入装有载体的层析柱中进行色谱分离的方法；亲和层析是用凝集素作为亲和色谱来分离多糖，适用于含量低、不稳定的活性物质。祝雯[6]用DEAE阴离子交换柱和Sephacryls200凝胶层析柱纯化获得高品质的河蚬多糖；范秀萍[7]用DEAE52纤维素柱纯化珠母贝氨基多糖，获得高品质的氨基多糖；张铂等[8]经过大孔吸附层析、凝胶过滤层析等方法纯化获得文蛤糖肽,并经HPLC (高效液相色谱)检测为单一对称峰；陈骏洪[9]经过DEAE52离子交换层析和SephadexG100凝胶过滤层析分离纯化，分别用0、0.5M NaCI洗脱得到两种主要组分；廖宁波[10]运用阴离子交换柱和凝胶层析柱对河蚬粗多糖进行分离纯化，得到两个组分；李孟婕[11]采用DEAE52纤维素离子交换柱层析和Sephadex G200凝胶柱纯化得到含量较高两个组分；叶琳[12]用DEAEsephacel阴离子交换柱和Sepharose 6B凝胶柱进行分离纯化，得到两个多糖组分；叶双喜[13]用DEAE52纤维柱和Sephadex G200分离纯化得到得两个多糖组分；蒋长兴[14] 采用DEAE52纤维素柱层析法和Sephdex G100凝胶柱层析分离纯化青蛤粗多糖得到三个组分；李世杰[15] 用DEAE纤维素52阴离子交换柱及Sephadex G100凝胶柱分离纯化粗多糖,得到纯化多糖组分；陈静波[16]选用琼脂糖凝胶Sepharose 4B柱层析，纯化获得两种贻贝水提的水溶性多糖。
1. 2 多糖理化性质研究
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