响应面法优化秦岭龙胆多糖的超声提取工艺研究(附件)
摘 要本论文利用单因素实验结合响应曲面法(RSM)优化秦岭龙胆中多糖的提取工艺。在单因素基础上选取试验因素水平，根据中心组合设计原理采用三因素三水平的响应面分析法进行最佳工艺的优化，研究料液比、超声时间、离心时间对秦岭龙胆多糖提取率的影响。最终结果表明，在分析各个因素的显著性和交互作用后，得到秦岭龙胆多糖最佳工艺为在提取时间为10分钟，离心时间为8分钟，料夜比为8:1时，多糖提取率为9.5%。该法不仅降低实验时间，而且其稳定、简单、高效率的特点为龙胆多糖提取工艺的优化提供了参考。
Keywords: Gentiana apiata ；polysaccharide；ultrasonic extraction；Response surface methodology. 目 录
1 绪论 1
1.1 研究的内容及意义 1
1.2多糖研究现状 1
1.3 秦岭龙胆研究进展 2
1.3.1生药学研究 2
1.3.2化学成分 4
1.3.3提取工艺 4
1.3.4药理作用 5
1.4响应面法简介[24] 6
2 实验部分 7
2.1 实验药材与试剂 7
2.1.1 材料 7
2.1.2 试剂 7
2.2 仪器 7
2.3 实验内容 7
2.3.1 秦岭龙胆的药材处理 7
2.3.2 标准曲线制备 7
2.3.3 秦岭龙胆多糖提取率的计算 8
2.3.4 各离心时间因素对秦岭龙胆多糖提取率单因素分析 8
2.3.5 因素水平表 11
2.3.6 响应曲面试验结果及分析 11
2.4 结论 16
结 语 18
参考文献 20
致 谢 23
1 绪论
1.1 研究的内容及意义
秦岭龙胆是秦巴山区特有的药用植物资源。其药性苦、平，归肝、胆、膀胱经。有调经活血，清热明目，利小便的功效，主治月经不调，痛经，头晕失眠，小便不利，淋症，崩漏，白带，痢疾，腹痛（出自《陕西 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
中草药》）。多糖作为秦岭龙胆药材当中一种很重要的活性成分，其具有抗癌、抗氧化和降糖的生物活性[1]。为了更好地开发利用秦岭龙胆，本次研究采用单因素研究结合BoxBehnken试验法对秦岭龙胆多糖的超声提取工艺进行优化，从经济，环保与提取率等方面综合考虑，选取最佳工艺参数，提高了其生产效率，为秦岭龙胆资源的研究开发提供了良好的参照。
1.2多糖研究现状
多糖又叫做多聚糖，由1020个及以上单糖缩合而成而成的链状结构[2]，大多以结合态存在，也有一部分以游离态的形式存在。从20世纪50年代对真菌多糖的抗癌效果的发现以来，人们开始对多糖的化学、物理、生物方面的研究不断深入。近年来随着分子生物学的发展，人们逐渐认识到多糖及其复合物分子具有及其重要的生物学功能，它不仅是生物机体组成的重要的物质，也常作为储存能量的物质参与到机体的新陈代谢中。多糖在食品工业、发酵工业及石油工业上也有着广泛的应用。因此，在开展多糖资源的开发、多糖结构的分析、多糖药理作用等的研究方面,人们做了大量的工作。目前,多糖的研究以日本、美国、德国、俄罗斯等国处于领先地位。
由于植物多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗衰老，降血糖、抗氧化等多种生物活性毒副作用小、不易造成残留等优点[3]，近年来对植物多糖的研究呈现出一个增长的趋势。对于多糖提取方法方面的研究在我们实验中最常见的是通过纯化水加热的方法进行提取，但是随着物理理论与实践的相互结合，溶剂提取法、超声辅助提取法、微波法、酶法、超临界流体萃取法等也在多糖提取过程应用越来越普遍[4]。
从七十年代到现在，伴随着现代医学、细胞分子学、生物学、病毒学等研究的深入，科研人员发现在生物体中存在的多糖具有很大的研究意义和研究价值，并且多糖在一些生物体中比较复杂 [5]。生物体细胞表面的抗原多是一些糖链残基；生物体中大多数的功能蛋白也是或多或少地结合有糖链的糖蛋白；并且细胞表面的糖链含有非常丰富的生物学信息，糖链分子量的变化、糖链所含残基的变化及糖链三维空间结构的变化预示了细胞的各种生理状态，如分裂、转化、病变等。可以说糖类化合物决定了细胞表面各种作用的特异性，同时多糖类物质还参与了细胞各种生理活动的调节[6]。因而经过近三十年的研究，多糖类化合物己经发展为一种免疫疗法，通过激活免疫细胞来提高机体的免疫功能，同时对于正常的细胞没有毒副作用，在这一点上它对肿瘤的治疗比手术、化疗和放疗都要优越的多[7]。关于多糖的结构以及生物功能的研究已经成为蛋白质和核酸后的第3个探索生命奥秘的重要里程。多糖因其广泛和无毒，在抗氧化衰老、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节和调节血糖等方面的药理作用显著，表现出了良好的发展应用前景，对多糖的分离提取、药理作用和结构成分的研究已成为一大热点。
1.3 秦岭龙胆研究进展
秦岭龙胆（Gentiana apiata N.E.Br）又名茱苓草，属龙胆属龙胆科植物。由于产自秦岭太白山，故名秦岭龙胆，以干燥的带花全草入药。性味“苦、平”，民间常用其治疗消化道疾病及妇科疾病[8]。
1.3.1生药学研究
(1)原植物形态[9]
多年生草本,高20~55。m。根茎斜生,具不明显的节。茎直立,近圆柱形,中空。不育枝的叶全部基生,披针形或狭长圆形,全缘,中脉明显。花枝叶片狭长圆形,尖端钝尖或急尖,全缘,基部连合抱茎。聚伞花序顶生或腋生,常2~3花,稀单生。花黄绿色,具蓝黑色斑点。蒴果卵状椭圆形,种子多数,黄褐色,卵状菱形。花期7~8月,果期8~9月。
图 1.1 秦岭龙胆原植物形态（《陕西中草药》）
(2)生药性状[10]
为干燥带根全草，茎圆柱形，黄褐色或褐色，表面具有=细皱纹。叶倒被针形或线状披针形，长2～8cm，宽0.5～1.2cm，先端尖，基部渐狭，主脉明显。花冠钟状褶叠，黄绿色，有深色小点散在，根茎弯曲，黄棕色至深褐色，有横环纹，长2～6cm，直径0.2～0.6cm，质坚硬，不易折断，断面皮部灰棕色，木部黄白色，中央髓部浅褐色，有时中空。根细长，完整者长4～8cm，直径约0.1cm，淡黄棕色至深棕色，平滑或微有细纵纹，质脆易断，断面黄色，气微，味极苦。
龙胆图 1.2秦岭药材
1.3.2化学成分
王宁[11]等通过不同的化学反应对秦岭龙胆进行了初步的定性分析，结果表明其主要含有糖、多糖甙类，酚性成分，生物碱，甾体(植物甾醇)、萜类成分，黄酮及其甙类，内酯、香豆素或其甙类，鞣质，蛋白质，有机酸，油脂类等化学成分。同时采用溶剂提取、硅胶柱层析分离，Sephadex LH20、101大孔树脂纯化等方法，分离得到了四个化合物异荭草甙(Isoorientin)、龙胆苦甙(Gentiopicrin)、秦岭龙胆甙A、秦岭龙胆二糖等四个单体成分。许海燕[12]通过不同的化学反应对秦岭龙胆进行了初步的定性分析，结果表明其化学成分主要含有糖及其苷类、酚性成分、生物碱、甾体、萜类成分、黄酮及其苷类、内酯、香豆素及其苷类、鞣质、蛋白质、有机酸性成分、挥发油、油脂类成分。在此基础上后续学者对秦岭龙胆的化学成分进行了系统的研究，杨明利[13]采用试管法对秦岭龙胆全草化学成分进行了系统预试，由结果初步确定其含有糖，内酯、香豆素及其苷类，酚性成分，黄酮及其苷类，生物碱类，甾萜类成分，鞣质，有机酸和挥发油等；不含强心苷，蒽醌及其苷。李兴科[14]采用70％乙醇超声提取，将所得浸膏悬浮于50℃热水中，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取。留下的水相部分，应用大孔树脂L,SA30，硅胶柱层析分离、Sephadex LH20葡聚糖凝胶柱纯化，最终分离得到9个化合物。通过波谱分析与已知品对照的方法对其中七个进行了鉴定。其中新化合物鉴定为：isoswertiajaposide A(Lxk4)。周乐[15]等人通过从秦岭龙胆(Gentiana apiata N.E.Br.)全草的乙醇提取物中首次分离得到4个化合物,通过波谱分析分别鉴定为异荭草甙(isoorientin Ⅰ)、龙胆苦甙(gentiopicroside Ⅱ)、秦岭龙胆甙A(apiatoside A Ⅲ)和蔗糖(D(+)sucrose Ⅳ),其中Ⅲ为新化合物。杨维霞[16]通过从秦岭龙胆(Gentiana apiata N.E.Br.)全草的乙醇提取物中首次分离得到4个化合物,通过波谱分析分别鉴定为异荭草甙(isoorientin Ⅰ)、龙胆苦甙(gentiopicroside Ⅱ)、秦岭龙胆甙A(apiatoside A Ⅲ)和蔗糖(D(+)sucrose Ⅳ),其中Ⅲ为新化合物。
Keywords: Gentiana apiata ；polysaccharide；ultrasonic extraction；Response surface methodology. 目 录
1 绪论 1
1.1 研究的内容及意义 1
1.2多糖研究现状 1
1.3 秦岭龙胆研究进展 2
1.3.1生药学研究 2
1.3.2化学成分 4
1.3.3提取工艺 4
1.3.4药理作用 5
1.4响应面法简介[24] 6
2 实验部分 7
2.1 实验药材与试剂 7
2.1.1 材料 7
2.1.2 试剂 7
2.2 仪器 7
2.3 实验内容 7
2.3.1 秦岭龙胆的药材处理 7
2.3.2 标准曲线制备 7
2.3.3 秦岭龙胆多糖提取率的计算 8
2.3.4 各离心时间因素对秦岭龙胆多糖提取率单因素分析 8
2.3.5 因素水平表 11
2.3.6 响应曲面试验结果及分析 11
2.4 结论 16
结 语 18
参考文献 20
致 谢 23
1 绪论
1.1 研究的内容及意义
秦岭龙胆是秦巴山区特有的药用植物资源。其药性苦、平，归肝、胆、膀胱经。有调经活血，清热明目，利小便的功效，主治月经不调，痛经，头晕失眠，小便不利，淋症，崩漏，白带，痢疾，腹痛（出自《陕西 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
中草药》）。多糖作为秦岭龙胆药材当中一种很重要的活性成分，其具有抗癌、抗氧化和降糖的生物活性[1]。为了更好地开发利用秦岭龙胆，本次研究采用单因素研究结合BoxBehnken试验法对秦岭龙胆多糖的超声提取工艺进行优化，从经济，环保与提取率等方面综合考虑，选取最佳工艺参数，提高了其生产效率，为秦岭龙胆资源的研究开发提供了良好的参照。
1.2多糖研究现状
多糖又叫做多聚糖，由1020个及以上单糖缩合而成而成的链状结构[2]，大多以结合态存在，也有一部分以游离态的形式存在。从20世纪50年代对真菌多糖的抗癌效果的发现以来，人们开始对多糖的化学、物理、生物方面的研究不断深入。近年来随着分子生物学的发展，人们逐渐认识到多糖及其复合物分子具有及其重要的生物学功能，它不仅是生物机体组成的重要的物质，也常作为储存能量的物质参与到机体的新陈代谢中。多糖在食品工业、发酵工业及石油工业上也有着广泛的应用。因此，在开展多糖资源的开发、多糖结构的分析、多糖药理作用等的研究方面,人们做了大量的工作。目前,多糖的研究以日本、美国、德国、俄罗斯等国处于领先地位。
由于植物多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗衰老，降血糖、抗氧化等多种生物活性毒副作用小、不易造成残留等优点[3]，近年来对植物多糖的研究呈现出一个增长的趋势。对于多糖提取方法方面的研究在我们实验中最常见的是通过纯化水加热的方法进行提取，但是随着物理理论与实践的相互结合，溶剂提取法、超声辅助提取法、微波法、酶法、超临界流体萃取法等也在多糖提取过程应用越来越普遍[4]。
从七十年代到现在，伴随着现代医学、细胞分子学、生物学、病毒学等研究的深入，科研人员发现在生物体中存在的多糖具有很大的研究意义和研究价值，并且多糖在一些生物体中比较复杂 [5]。生物体细胞表面的抗原多是一些糖链残基；生物体中大多数的功能蛋白也是或多或少地结合有糖链的糖蛋白；并且细胞表面的糖链含有非常丰富的生物学信息，糖链分子量的变化、糖链所含残基的变化及糖链三维空间结构的变化预示了细胞的各种生理状态，如分裂、转化、病变等。可以说糖类化合物决定了细胞表面各种作用的特异性，同时多糖类物质还参与了细胞各种生理活动的调节[6]。因而经过近三十年的研究，多糖类化合物己经发展为一种免疫疗法，通过激活免疫细胞来提高机体的免疫功能，同时对于正常的细胞没有毒副作用，在这一点上它对肿瘤的治疗比手术、化疗和放疗都要优越的多[7]。关于多糖的结构以及生物功能的研究已经成为蛋白质和核酸后的第3个探索生命奥秘的重要里程。多糖因其广泛和无毒，在抗氧化衰老、抗病毒、抗肿瘤、免疫调节和调节血糖等方面的药理作用显著，表现出了良好的发展应用前景，对多糖的分离提取、药理作用和结构成分的研究已成为一大热点。
1.3 秦岭龙胆研究进展
秦岭龙胆（Gentiana apiata N.E.Br）又名茱苓草，属龙胆属龙胆科植物。由于产自秦岭太白山，故名秦岭龙胆，以干燥的带花全草入药。性味“苦、平”，民间常用其治疗消化道疾病及妇科疾病[8]。
1.3.1生药学研究
(1)原植物形态[9]
多年生草本,高20~55。m。根茎斜生,具不明显的节。茎直立,近圆柱形,中空。不育枝的叶全部基生,披针形或狭长圆形,全缘,中脉明显。花枝叶片狭长圆形,尖端钝尖或急尖,全缘,基部连合抱茎。聚伞花序顶生或腋生,常2~3花,稀单生。花黄绿色,具蓝黑色斑点。蒴果卵状椭圆形,种子多数,黄褐色,卵状菱形。花期7~8月,果期8~9月。
图 1.1 秦岭龙胆原植物形态（《陕西中草药》）
(2)生药性状[10]
为干燥带根全草，茎圆柱形，黄褐色或褐色，表面具有=细皱纹。叶倒被针形或线状披针形，长2～8cm，宽0.5～1.2cm，先端尖，基部渐狭，主脉明显。花冠钟状褶叠，黄绿色，有深色小点散在，根茎弯曲，黄棕色至深褐色，有横环纹，长2～6cm，直径0.2～0.6cm，质坚硬，不易折断，断面皮部灰棕色，木部黄白色，中央髓部浅褐色，有时中空。根细长，完整者长4～8cm，直径约0.1cm，淡黄棕色至深棕色，平滑或微有细纵纹，质脆易断，断面黄色，气微，味极苦。
龙胆图 1.2秦岭药材
1.3.2化学成分
王宁[11]等通过不同的化学反应对秦岭龙胆进行了初步的定性分析，结果表明其主要含有糖、多糖甙类，酚性成分，生物碱，甾体(植物甾醇)、萜类成分，黄酮及其甙类，内酯、香豆素或其甙类，鞣质，蛋白质，有机酸，油脂类等化学成分。同时采用溶剂提取、硅胶柱层析分离，Sephadex LH20、101大孔树脂纯化等方法，分离得到了四个化合物异荭草甙(Isoorientin)、龙胆苦甙(Gentiopicrin)、秦岭龙胆甙A、秦岭龙胆二糖等四个单体成分。许海燕[12]通过不同的化学反应对秦岭龙胆进行了初步的定性分析，结果表明其化学成分主要含有糖及其苷类、酚性成分、生物碱、甾体、萜类成分、黄酮及其苷类、内酯、香豆素及其苷类、鞣质、蛋白质、有机酸性成分、挥发油、油脂类成分。在此基础上后续学者对秦岭龙胆的化学成分进行了系统的研究，杨明利[13]采用试管法对秦岭龙胆全草化学成分进行了系统预试，由结果初步确定其含有糖，内酯、香豆素及其苷类，酚性成分，黄酮及其苷类，生物碱类，甾萜类成分，鞣质，有机酸和挥发油等；不含强心苷，蒽醌及其苷。李兴科[14]采用70％乙醇超声提取，将所得浸膏悬浮于50℃热水中，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取。留下的水相部分，应用大孔树脂L,SA30，硅胶柱层析分离、Sephadex LH20葡聚糖凝胶柱纯化，最终分离得到9个化合物。通过波谱分析与已知品对照的方法对其中七个进行了鉴定。其中新化合物鉴定为：isoswertiajaposide A(Lxk4)。周乐[15]等人通过从秦岭龙胆(Gentiana apiata N.E.Br.)全草的乙醇提取物中首次分离得到4个化合物,通过波谱分析分别鉴定为异荭草甙(isoorientin Ⅰ)、龙胆苦甙(gentiopicroside Ⅱ)、秦岭龙胆甙A(apiatoside A Ⅲ)和蔗糖(D(+)sucrose Ⅳ),其中Ⅲ为新化合物。杨维霞[16]通过从秦岭龙胆(Gentiana apiata N.E.Br.)全草的乙醇提取物中首次分离得到4个化合物,通过波谱分析分别鉴定为异荭草甙(isoorientin Ⅰ)、龙胆苦甙(gentiopicroside Ⅱ)、秦岭龙胆甙A(apiatoside A Ⅲ)和蔗糖(D(+)sucrose Ⅳ),其中Ⅲ为新化合物。
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