田螺多糖Cr(III)螯合物的合成工艺研究
目 录
1 引言 1
1.1 糖铬络合物制备方法 1
1.2 铬络合物中铬含量的检测方法 2
1.3 糖类金属配合物结构表征方法 3
1.4 本文研究的主要内容及目的 3
2 实验方法 4
2.1 实验仪器、试剂与材料 4
2.2 田螺多糖与Cr(III)螯合的工艺 5
2.3 田螺多糖Cr(III)螯合工艺条件的优化 5
2.4最佳工艺的验证实验 7
2.5红外光谱分析田螺多糖与Cr(III)螯合的结构表征 8
3 实验结果与结论 8
3.1 田螺多糖与Cr(III)螯合工艺条件的考察结果 8
3.2 最佳工艺的验证结果 17
3.3 红外光谱的分析结果 18
结 论 20
致 谢 21
参 考 文 献 22
1 引言
多糖(polysaccharide，简称PS)是一类具有广泛生物活性的生物大分子物质，目前已有300多种多糖类化合物从天然产物中被分离[1]。研究表明，田螺多糖具有许多重要的生理功能，如：降血糖[2-3]、降血脂[4-5]、抗肿瘤[6-7]、抗衰老[8] 、提高机体免疫等功能。铬是目前研究较多且结论较为一致的一种重要的微量元素[9]，人体缺铬会导致一系列的代谢失常及病变[10-11]。大量研究表明，微量元素铬在糖尿病诊断、治疗及预防中有重要的作用[12-13]。
随着人们生活水平的提高，糖尿病成为危害人类健康的一大疾病，且发病率逐年上升，引起人们的广泛关注[12]。研究表明，多糖与金属离子的螯合物具有某些特殊的生理生化功能[13-14] *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
，多糖螯合物不仅能够发挥多糖的强大生理功能，同时能够作为一种金属补充剂，有降血糖[15]、补锌等功效。目前已经报道了多糖与Fe(Ⅱ)、Zn、Ag等螯合物的制备工艺[16-18]。铬是过渡金属，在可食用领域的研究多数以蛋白质、多肽与铬螯合为主，少有多糖与铬进行螯合的相关报道，以田螺作为原料提取田螺多糖，充分发挥资源优势并且与铬螯合，通过考察影响其螯合率的主要因素，并应用响应面法获得最佳提取工艺，为其在食品、医药、保健品等方面的应用奠定基础。
1.1 糖铬络合物制备方法
1.1.1 酸碱法
葡萄糖酸铬合成是将0.15 g 的葡萄糖酸溶液加热到60℃，搅拌下加入0. 051 M 新制备的氢氧化铬溶液，反应18 h，当pH达4-5 时，停止反应，滤除未反应的氢氧化铬，浓缩加入乙醇析出葡萄糖酸铬，再用乙醇脱水得紫色葡萄糖酸铬粉末[28]。酸碱法制备糖铬配合物时，因氢氧化铬不溶于水，溶于酸、强碱，加热易分解为Cr2O3，反应条件难以控制。
1.1.2 复分解反应法或离子交换法
先通过酸碱反应制得中间体，再进行离子交换得到目标产物。在苏糖酸铬和氨基葡萄糖酸铬的制备中，先将配体与氢氧化钡反应生成相应钡盐，然后与硫酸铬反应得到铬配合物，制备过程中通过控制pH 得到不同形式的苏糖酸铬盐和氨基葡萄糖酸铬盐。而上述反应中使用了有毒原料氢氧化钡，中间产生的氢氧化铬、氢氧化钡难以从目标产物中去除。
海藻酸铬也是按此法制备，海藻酸为来自褐藻的多糖，由D-甘露糖醛酸和L-丁香、五倍子等10种中草药提取物对果蔬致腐真菌扩展青霉和黑曲霉的抑制作用，发现中草药丁香提取物具有较强的抗菌活性。马齿苋中含有丰富的黄酮类物质[18]，刘绍军等[19]发现马齿苋提取物对灰葡萄孢霉、黑曲霉和毛霉均有明显的抑制作用。
1.1.3沉淀吸附法
沉淀吸附法制备多糖铬是利用多糖本身不溶于乙醇的特点，在完成络合反应后，通过醇沉分离糖铬配合物。反应均需在碱性溶液中进行，依配体糖的不同，所用的pH 不同。黄芪多糖[26]和寡聚古罗糖醛酸[29]在pH为8-10 的范围内，聚甘露糖醛酸寡糖[30]需要接近pH为12，而麦冬多糖[27]的络合则需要在pH为12以上。
1.1.4 氧化还原法
碱性多糖配体采用氧化还原法，在酸溶液中反应制备糖铬络合物。中国专利( 2005) 中采用此法制备了几丁糖铬[25]。
纵观糖铬配合物制备方法的发展，以降糖为目的的糖铬配合物，糖配体的发展经历了从单糖、单糖衍生物到多糖又到寡糖的发展过程。随着多糖和寡糖制备和分离技术的发展，以及多糖、寡糖功能的揭示，制备反应的过程相对简单化，且无有害物质产生，制备的糖铬配合物的功能也更加完备。
目前国内外对天然修饰的多糖的报道大多来自于菌类、植物中，而从海洋软体动物中，尤其是贝类中提取多糖进行修饰的报道不多[10-12]。有关贝类多糖化学修饰的研究报道不多，且主要集中在多糖的硫酸化的研究上。田螺多糖硫酸酯化将可能具有较原先多糖更多的生物活性。为此，本文从新鲜的田螺中提取多糖，并进行分离纯化，从多个角度综述近年来国内外对多糖的硫酸酯化、药理作用等的研究进展，进而对田螺多糖硫酸酯化研究的新探讨。分别从取代度及结构表征等方面进行初步研究，为应用于保健食品与医药等领域提供理论依据。
1.2铬络合物中铬含量的检测方法
主要有分光光度法和原子吸收法[31-32]。两种方法测定总铬和Cr(III)时，都以KMnO4作氧化剂，把Cr(III) 氧化为Cr(VI) ，过量的KMnO4用NaNO2还原，过剩的NaNO2再以尿素分解。但如果操作不当，过量的NaNO2在酸性条件下能使Cr(VI) 重新还原成Cr(III)。用过硫酸钾代替高锰酸钾做氧化剂，则能避免上述问题的发生[33-34]。王改民等提出了直接测定Cr(III)的方法，Cr(III)与二甲酚橙显色，在Cr(III)含量0-16 μg /mL 范围内，其吸光度与Cr(III)含量成正相关，通过显著性检验，曲线与回归方程相关关系良好[35]。
1.3 糖类金属配合物结构表征方法
1.3.1 红外光谱、紫外光谱
糖类化合物的羟基是主要与金属离子发生配位作用的基团，红外光谱就能显示出明显区别，归属为羟基的吸收峰在发生配位反应后会有较大程度的位移（10-30 cm-1）。形成配合物后紫外光谱也有明显的区别，多糖在紫外光区是没有吸收的，当糖链中引入了金属离子后，由于金属离子的跃迁就发生了紫外吸收，同时由于金属离子与糖分子不是简单的物理混合状态，因而配合物吸收峰与金属离子本身吸收峰有一定差异。
1.3.2 元素分析和电感耦合等离子体原子发射光谱
单糖金属配合物可以通过元素分析确定C、H的含量，ICP-AES确定金属在配合物中的含量，从而推导出结构式。但是该推导方法不合适于寡糖和多糖金属配合物物。因为这两类糖类化合物结构复杂，一般无明确的分子结构。
1.3.3 核磁共振与电子自旋（顺磁）共振
氢谱中会显示出糖类金属配合物的配位点氢原子的共振峰消失，而碳谱中也能显示出以上配位点附近碳原子的共振峰受配位作用影响会有较大困难。
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1 引言 1
1.1 糖铬络合物制备方法 1
1.2 铬络合物中铬含量的检测方法 2
1.3 糖类金属配合物结构表征方法 3
1.4 本文研究的主要内容及目的 3
2 实验方法 4
2.1 实验仪器、试剂与材料 4
2.2 田螺多糖与Cr(III)螯合的工艺 5
2.3 田螺多糖Cr(III)螯合工艺条件的优化 5
2.4最佳工艺的验证实验 7
2.5红外光谱分析田螺多糖与Cr(III)螯合的结构表征 8
3 实验结果与结论 8
3.1 田螺多糖与Cr(III)螯合工艺条件的考察结果 8
3.2 最佳工艺的验证结果 17
3.3 红外光谱的分析结果 18
结 论 20
致 谢 21
参 考 文 献 22
1 引言
多糖(polysaccharide，简称PS)是一类具有广泛生物活性的生物大分子物质，目前已有300多种多糖类化合物从天然产物中被分离[1]。研究表明，田螺多糖具有许多重要的生理功能，如：降血糖[2-3]、降血脂[4-5]、抗肿瘤[6-7]、抗衰老[8] 、提高机体免疫等功能。铬是目前研究较多且结论较为一致的一种重要的微量元素[9]，人体缺铬会导致一系列的代谢失常及病变[10-11]。大量研究表明，微量元素铬在糖尿病诊断、治疗及预防中有重要的作用[12-13]。
随着人们生活水平的提高，糖尿病成为危害人类健康的一大疾病，且发病率逐年上升，引起人们的广泛关注[12]。研究表明，多糖与金属离子的螯合物具有某些特殊的生理生化功能[13-14] *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
，多糖螯合物不仅能够发挥多糖的强大生理功能，同时能够作为一种金属补充剂，有降血糖[15]、补锌等功效。目前已经报道了多糖与Fe(Ⅱ)、Zn、Ag等螯合物的制备工艺[16-18]。铬是过渡金属，在可食用领域的研究多数以蛋白质、多肽与铬螯合为主，少有多糖与铬进行螯合的相关报道，以田螺作为原料提取田螺多糖，充分发挥资源优势并且与铬螯合，通过考察影响其螯合率的主要因素，并应用响应面法获得最佳提取工艺，为其在食品、医药、保健品等方面的应用奠定基础。
1.1 糖铬络合物制备方法
1.1.1 酸碱法
葡萄糖酸铬合成是将0.15 g 的葡萄糖酸溶液加热到60℃，搅拌下加入0. 051 M 新制备的氢氧化铬溶液，反应18 h，当pH达4-5 时，停止反应，滤除未反应的氢氧化铬，浓缩加入乙醇析出葡萄糖酸铬，再用乙醇脱水得紫色葡萄糖酸铬粉末[28]。酸碱法制备糖铬配合物时，因氢氧化铬不溶于水，溶于酸、强碱，加热易分解为Cr2O3，反应条件难以控制。
1.1.2 复分解反应法或离子交换法
先通过酸碱反应制得中间体，再进行离子交换得到目标产物。在苏糖酸铬和氨基葡萄糖酸铬的制备中，先将配体与氢氧化钡反应生成相应钡盐，然后与硫酸铬反应得到铬配合物，制备过程中通过控制pH 得到不同形式的苏糖酸铬盐和氨基葡萄糖酸铬盐。而上述反应中使用了有毒原料氢氧化钡，中间产生的氢氧化铬、氢氧化钡难以从目标产物中去除。
海藻酸铬也是按此法制备，海藻酸为来自褐藻的多糖，由D-甘露糖醛酸和L-丁香、五倍子等10种中草药提取物对果蔬致腐真菌扩展青霉和黑曲霉的抑制作用，发现中草药丁香提取物具有较强的抗菌活性。马齿苋中含有丰富的黄酮类物质[18]，刘绍军等[19]发现马齿苋提取物对灰葡萄孢霉、黑曲霉和毛霉均有明显的抑制作用。
1.1.3沉淀吸附法
沉淀吸附法制备多糖铬是利用多糖本身不溶于乙醇的特点，在完成络合反应后，通过醇沉分离糖铬配合物。反应均需在碱性溶液中进行，依配体糖的不同，所用的pH 不同。黄芪多糖[26]和寡聚古罗糖醛酸[29]在pH为8-10 的范围内，聚甘露糖醛酸寡糖[30]需要接近pH为12，而麦冬多糖[27]的络合则需要在pH为12以上。
1.1.4 氧化还原法
碱性多糖配体采用氧化还原法，在酸溶液中反应制备糖铬络合物。中国专利( 2005) 中采用此法制备了几丁糖铬[25]。
纵观糖铬配合物制备方法的发展，以降糖为目的的糖铬配合物，糖配体的发展经历了从单糖、单糖衍生物到多糖又到寡糖的发展过程。随着多糖和寡糖制备和分离技术的发展，以及多糖、寡糖功能的揭示，制备反应的过程相对简单化，且无有害物质产生，制备的糖铬配合物的功能也更加完备。
目前国内外对天然修饰的多糖的报道大多来自于菌类、植物中，而从海洋软体动物中，尤其是贝类中提取多糖进行修饰的报道不多[10-12]。有关贝类多糖化学修饰的研究报道不多，且主要集中在多糖的硫酸化的研究上。田螺多糖硫酸酯化将可能具有较原先多糖更多的生物活性。为此，本文从新鲜的田螺中提取多糖，并进行分离纯化，从多个角度综述近年来国内外对多糖的硫酸酯化、药理作用等的研究进展，进而对田螺多糖硫酸酯化研究的新探讨。分别从取代度及结构表征等方面进行初步研究，为应用于保健食品与医药等领域提供理论依据。
1.2铬络合物中铬含量的检测方法
主要有分光光度法和原子吸收法[31-32]。两种方法测定总铬和Cr(III)时，都以KMnO4作氧化剂，把Cr(III) 氧化为Cr(VI) ，过量的KMnO4用NaNO2还原，过剩的NaNO2再以尿素分解。但如果操作不当，过量的NaNO2在酸性条件下能使Cr(VI) 重新还原成Cr(III)。用过硫酸钾代替高锰酸钾做氧化剂，则能避免上述问题的发生[33-34]。王改民等提出了直接测定Cr(III)的方法，Cr(III)与二甲酚橙显色，在Cr(III)含量0-16 μg /mL 范围内，其吸光度与Cr(III)含量成正相关，通过显著性检验，曲线与回归方程相关关系良好[35]。
1.3 糖类金属配合物结构表征方法
1.3.1 红外光谱、紫外光谱
糖类化合物的羟基是主要与金属离子发生配位作用的基团，红外光谱就能显示出明显区别，归属为羟基的吸收峰在发生配位反应后会有较大程度的位移（10-30 cm-1）。形成配合物后紫外光谱也有明显的区别，多糖在紫外光区是没有吸收的，当糖链中引入了金属离子后，由于金属离子的跃迁就发生了紫外吸收，同时由于金属离子与糖分子不是简单的物理混合状态，因而配合物吸收峰与金属离子本身吸收峰有一定差异。
1.3.2 元素分析和电感耦合等离子体原子发射光谱
单糖金属配合物可以通过元素分析确定C、H的含量，ICP-AES确定金属在配合物中的含量，从而推导出结构式。但是该推导方法不合适于寡糖和多糖金属配合物物。因为这两类糖类化合物结构复杂，一般无明确的分子结构。
1.3.3 核磁共振与电子自旋（顺磁）共振
氢谱中会显示出糖类金属配合物的配位点氢原子的共振峰消失，而碳谱中也能显示出以上配位点附近碳原子的共振峰受配位作用影响会有较大困难。
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