黄芩内源酶制备及其酶指纹分析研究(附件)
目的 黄芩作为一种常见大宗药材，其有关内源酶作用研究较少，本文旨在进行黄芩内源酶制备及其酶活性分析研究。方法 采用稍加修改的生物酶制备方法从黄芩药材提取制备内源酶，硝基苯酚显色法测定内源酶中葡萄糖苷酶及葡萄糖醛酸苷酶的活力及考察絮凝剂对内源酶提取的影响，HPLC法测定内源酶的催化转化能力。结果 硝基苯酚显色可有效测定黄芩内源酶中的葡萄糖苷酶及葡萄糖醛酸苷酶活力，絮凝剂及其分子量可显著影响内源酶活力，分子量为24000的PVP为最优的絮凝剂；pH 6.0-7.5缓冲液中内源酶提取效率较高，pH 6.5缓冲液为最适提取缓冲液。结论 PVP为中药材内源酶提取时的一类可有效提高酶活力的絮凝剂，分子量为24000的PVP为黄芩内源酶提取时有效的絮凝剂。因实验量有限，其结论有待进一步研究。关键词 黄芩内源酶，絮凝剂，PVP，酶活
目 录
1 引言 1
1.1 黄芩概述 1
1.2 中药材内源酶概述 1
1.3 酶活指纹分析研究进展 2
1.4 研究目的与内容 3
2 实验部分 4
2.1 实验设备与材料 4
2.2 药材内源酶提取 4
2.3 糖苷酶活力测定 6
2.4 内源酶的蛋白含量测定 8
2.5黄芩活性成分分析 8
3 结果与讨论 9
3.1酶活力测定 9
3.2蛋白含量测定 12
3.3 黄芩水解作用与活性成分分析 13
结 论 19
致 谢 20
参 考 文 献 21
1 引言
1.1 黄芩概述
黄芩为唇形科植物黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根，别称山茶根、土金茶根，性寒、味苦，具有清热燥湿、泻火解毒、止血安胎等功效[1,2]。黄芩用途广泛，药用历史悠久，是大宗药材之一[3]。我国黄芩属植物有数百种，河北承德是其道地产区，内蒙古、山东、山西、甘肃、陕西一带也有黄芩生产，各产地黄芩具有其明显产地特性[4]。黄芩临床使用量大，为满足供求，国内已大量栽植。
黄芩的化学成分较多，主要为黄酮类化合物，目前已 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
知有四十余种[5]，其中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素为主要活性成分。黄芩苷为2015版中国药典中黄芩药材的指标成分，含量越高质量越佳[6]。
由于黄芩属植物在传统医学中作为药用植物具有重要用途[7]，因此诸多国内外学者对黄芩药理作用的研究日益深入。目前在黄芩药材中已发现的物质成分均有一定的药理作用，如解热镇痛、保肝、利胆、利尿、抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗过敏、抗肿瘤、抗凝血和抗血栓形成、清除自由基等药理作用[8]。黄芩的药理作用为药品的研发提供了坚实的理论基础和良好的应用前景。
1.2 中药材内源酶概述
大部分中药材来源于药用植物，如黄芩为唇形科植物黄芩的根。中药内源酶是由一系列存在于生药材中具有生物催化活性的酶组成，如糖苷酶、酯类水解酶、蛋白酶等。
1.2.1 糖苷酶
一类能将含糖化合物中的糖苷键水解的酶称为糖苷酶，它是维持生物体基本功能的重要酶类之一，几乎所有动植物及微生物中均有糖苷酶存在[9]，黄芩中的重要酶类则非β葡萄糖醛酸苷酶莫属。酶的亚型在某些种属中有所不同，甚至具有很强的底物专一性。如人肠内菌甘草真杆菌含有的甘草次酸单葡萄糖醛酸βD葡萄糖醛酸酶具有特异性水解甘草次酸单葡萄糖醛酸苷为甘草次酸的性质[10]。
20世纪30 年代Miwa[11,12]发现黄芩药材的根部含有黄芩苷酶，黄芩素便是由黄芩苷酶水解黄芩苷而来。经研究证明，黄芩素是在人体内发挥作用的主要成分。黄芩苷口服不易吸收，经由肠道中酶水解作用，转化为黄芩素后方可吸收。上世纪中叶，Levvy[13]也从黄芩根部提取制备出了黄芩苷酶，并对酶水解特性进行了深入研究，发现其对βD吡喃葡萄糖醛酸苷的催化水解具有专一性。
黄酮类化合物在内源性酶的水解作用下可生成苷元。不同温度下的黄芩苷酶降解黄芩苷的活性具有明显差异，李建华等[14]研究发现水温在50℃时，黄芩内源酶降解黄芩苷的活性最强。
1.2.2 酯类水解酶
酯类水解酶种类繁多，其中，酯酶和脂肪酶是最重要的两类酯水解酶，广泛存在于动植物与微生物中[15]。二者皆可催化酯键的水解与合成，由于催化反应的热动力学，在水相中可催化酯类物质的水解，在有机相中则可催化酯类物质的合成。
1999年，Arpigny等人[16]选取了53种细菌的酯酶和脂肪酶的氨基酸序列进行对比分类，按照酶的保守序列基序和生物特性将其划分为八个家族。酯酶和脂肪酶因其选择性与特异性而广泛应用于洗涤剂工业、制药、食品、农业等行业[17]。
1.2.3 蛋白酶
蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶果实和微生物中，是一类催化蛋白质水解生成多肽和氨基酸的酶，具有不同的生理功能。蛋白酶种类众多，结构各异，各类蛋白酶大相径庭，因此可以根据最适温度、最适pH、作用机理等可进行分类命名。蛋白酶在工业上应用广泛，调查研究表明，在所有工业用酶制剂中，大约75%的酶制剂为蛋白水解酶[18]。随着生物技术的快速发展，蛋白酶的研究取得较大进展，但我国对于蛋白酶的研究仍有许多不足之处需要改进和完善。由于微生物资源开发不足、蛋白酶品种较少、酶作用范围较小、酶制剂品种单一、价格相对较贵等问题，在工业应用中不够深入广泛。因此，开发与寻找新蛋白酶、进一步掌握其相关特性仍是研究蛋白酶的重中之重[19]。
1.3 酶活指纹分析研究进展
酶最重要的性质便是选择性。其选择性包括底物、反应类型，反应条件和产物范围等。酶选择性决定其自身的固有属性。在实际应用过程中，它相较于具体的化学结构则更为重要。这主要是因为目前的理论还不能指导我们从酶的分子结构中精确地推断出酶的选择性。酶的选择性研究实质上就是研究单个酶对一系列底物的催化活性和在不同反应条件下的催化活性。与化学结构相比，在描绘酶活性谱方面，长期以来都没有一个普遍接受的形式。
目 录
1 引言 1
1.1 黄芩概述 1
1.2 中药材内源酶概述 1
1.3 酶活指纹分析研究进展 2
1.4 研究目的与内容 3
2 实验部分 4
2.1 实验设备与材料 4
2.2 药材内源酶提取 4
2.3 糖苷酶活力测定 6
2.4 内源酶的蛋白含量测定 8
2.5黄芩活性成分分析 8
3 结果与讨论 9
3.1酶活力测定 9
3.2蛋白含量测定 12
3.3 黄芩水解作用与活性成分分析 13
结 论 19
致 谢 20
参 考 文 献 21
1 引言
1.1 黄芩概述
黄芩为唇形科植物黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根，别称山茶根、土金茶根，性寒、味苦，具有清热燥湿、泻火解毒、止血安胎等功效[1,2]。黄芩用途广泛，药用历史悠久，是大宗药材之一[3]。我国黄芩属植物有数百种，河北承德是其道地产区，内蒙古、山东、山西、甘肃、陕西一带也有黄芩生产，各产地黄芩具有其明显产地特性[4]。黄芩临床使用量大，为满足供求，国内已大量栽植。
黄芩的化学成分较多，主要为黄酮类化合物，目前已 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
知有四十余种[5]，其中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素为主要活性成分。黄芩苷为2015版中国药典中黄芩药材的指标成分，含量越高质量越佳[6]。
由于黄芩属植物在传统医学中作为药用植物具有重要用途[7]，因此诸多国内外学者对黄芩药理作用的研究日益深入。目前在黄芩药材中已发现的物质成分均有一定的药理作用，如解热镇痛、保肝、利胆、利尿、抗菌、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗过敏、抗肿瘤、抗凝血和抗血栓形成、清除自由基等药理作用[8]。黄芩的药理作用为药品的研发提供了坚实的理论基础和良好的应用前景。
1.2 中药材内源酶概述
大部分中药材来源于药用植物，如黄芩为唇形科植物黄芩的根。中药内源酶是由一系列存在于生药材中具有生物催化活性的酶组成，如糖苷酶、酯类水解酶、蛋白酶等。
1.2.1 糖苷酶
一类能将含糖化合物中的糖苷键水解的酶称为糖苷酶，它是维持生物体基本功能的重要酶类之一，几乎所有动植物及微生物中均有糖苷酶存在[9]，黄芩中的重要酶类则非β葡萄糖醛酸苷酶莫属。酶的亚型在某些种属中有所不同，甚至具有很强的底物专一性。如人肠内菌甘草真杆菌含有的甘草次酸单葡萄糖醛酸βD葡萄糖醛酸酶具有特异性水解甘草次酸单葡萄糖醛酸苷为甘草次酸的性质[10]。
20世纪30 年代Miwa[11,12]发现黄芩药材的根部含有黄芩苷酶，黄芩素便是由黄芩苷酶水解黄芩苷而来。经研究证明，黄芩素是在人体内发挥作用的主要成分。黄芩苷口服不易吸收，经由肠道中酶水解作用，转化为黄芩素后方可吸收。上世纪中叶，Levvy[13]也从黄芩根部提取制备出了黄芩苷酶，并对酶水解特性进行了深入研究，发现其对βD吡喃葡萄糖醛酸苷的催化水解具有专一性。
黄酮类化合物在内源性酶的水解作用下可生成苷元。不同温度下的黄芩苷酶降解黄芩苷的活性具有明显差异，李建华等[14]研究发现水温在50℃时，黄芩内源酶降解黄芩苷的活性最强。
1.2.2 酯类水解酶
酯类水解酶种类繁多，其中，酯酶和脂肪酶是最重要的两类酯水解酶，广泛存在于动植物与微生物中[15]。二者皆可催化酯键的水解与合成，由于催化反应的热动力学，在水相中可催化酯类物质的水解，在有机相中则可催化酯类物质的合成。
1999年，Arpigny等人[16]选取了53种细菌的酯酶和脂肪酶的氨基酸序列进行对比分类，按照酶的保守序列基序和生物特性将其划分为八个家族。酯酶和脂肪酶因其选择性与特异性而广泛应用于洗涤剂工业、制药、食品、农业等行业[17]。
1.2.3 蛋白酶
蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶果实和微生物中，是一类催化蛋白质水解生成多肽和氨基酸的酶，具有不同的生理功能。蛋白酶种类众多，结构各异，各类蛋白酶大相径庭，因此可以根据最适温度、最适pH、作用机理等可进行分类命名。蛋白酶在工业上应用广泛，调查研究表明，在所有工业用酶制剂中，大约75%的酶制剂为蛋白水解酶[18]。随着生物技术的快速发展，蛋白酶的研究取得较大进展，但我国对于蛋白酶的研究仍有许多不足之处需要改进和完善。由于微生物资源开发不足、蛋白酶品种较少、酶作用范围较小、酶制剂品种单一、价格相对较贵等问题，在工业应用中不够深入广泛。因此，开发与寻找新蛋白酶、进一步掌握其相关特性仍是研究蛋白酶的重中之重[19]。
1.3 酶活指纹分析研究进展
酶最重要的性质便是选择性。其选择性包括底物、反应类型，反应条件和产物范围等。酶选择性决定其自身的固有属性。在实际应用过程中，它相较于具体的化学结构则更为重要。这主要是因为目前的理论还不能指导我们从酶的分子结构中精确地推断出酶的选择性。酶的选择性研究实质上就是研究单个酶对一系列底物的催化活性和在不同反应条件下的催化活性。与化学结构相比，在描绘酶活性谱方面，长期以来都没有一个普遍接受的形式。
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