胡萝卜软腐果胶杆菌rsmb基因致病相关功能分析
胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（Pectobacterterium carotovorum subsp. carotovorum, 以下简称Pcc）是引起细菌性软腐病的重要病原菌。它寄主广泛，可侵染多种经济作物及观赏性植物，并且造成严重的经济损失。本实验通过基因进行定向敲除，获得胡萝卜软腐果胶杆菌rsmB基因的缺失突变株，完成游动性、沉降性、生物膜测定等生物学特性测定、白菜叶柄致病性测定以及果胶酶、蛋白酶、纤维素酶等致病因子测定，探索rsmB基因的缺失突变株与Pcc致病性的关系。
目录
摘要4
关键词4
Abstract4
Key words4
引言（或绪论）4
1材料与方法5
1.1材料 5
1.1.1供试菌株、质粒及培养条件5
1.1.2培养基5
1.1.3抗生素及抗生素浓度6
1.1.4菌株培养及保存6
1.1．5主要试剂和仪器6
1.1．6引物和限制性内切酶6
1.2缺失突变体的构建6
1.2.1质粒的提取6
1.2.2DNA的酶切7
1.2.3化学感受态细胞的制备7
1.2.4化学转化7
1.2.5 DNA片段的PCR扩增和纯化7
1.2.6两亲交配得到的突变缺失体8
1.3致病性的测定8
1.4相关生物学特性的测定8
1.4.1游动性测定8
1.4.2沉降性测定8
1.4.3生物膜活性测定8
1.5相关致病因子的测定9
1.5.1纤维素酶活性测定9
1.5.2蛋白酶活性测定9
1.5.3果胶酶活性测定9
1.5.4碳青霉烯抗生素9
2结果与分析9
2.1突变菌株的构建9
2.2致病性测定9
2.3生物学特性测定结果10
2.3.1游动性测定结果 10
2.3.2沉降性测定结果10
2.3.3生物膜测定结果10
2.3.4碳青 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
霉烯抗生素10
2.4致病相关因子测定结果11
2.4.1纤维素酶活性测定结果11
2.4.2果胶酶活性测定结果11
2.4.3蛋白酶活性测定结果11
3讨论11
致谢11
参考文献12
胡萝卜软腐果胶杆菌rsmB基因致病相关功能分析
引言
彩色马蹄莲(Zantedeschia spp.)是高档的单子叶观赏植物。侵染彩色马蹄莲的病原菌分为三类：病毒、真菌和细菌。其中，细菌性病害的细菌性软腐病的发生是彩色马蹄莲生产中的最大难题，所有彩色马蹄莲的杂交种都不同程度地感病[1]。引起此类病害的主要病原菌有：胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pcc，1998年前为 Erwinia carotovora subsp. carotovora)、胡萝卜软腐果胶杆菌黑胫亚种(Pectobacterterium carotovorum subsp. atroseptica, 1998年前为 Erwinia carotovora subsp. atroseptica)和菊欧文氏菌(Dickeya dadantii,1998年前为 Erwinia chrysanthemi)[2~4]。其中胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种为我国细菌性软腐病的最主要病原细菌，可侵染多种寄主，包括十字花科、茄科、豆科、伞形科和葫芦科等多种蔬菜及多种观赏花卉植物[5~6]。
病原菌入侵植株并致使植物发病的过程其实质是病原菌与寄主发生相互作用的过程，Pcc在这一过程中产生了胞外水解酶、植物毒素和碳青霉烯抗生素等一系列致病因子[7~8]。胡萝卜软腐果胶杆菌的致病因子有生物膜、游动性、细胞壁降解酶（纤维素酶、蛋白酶、果胶酶）、脂多糖等。Pcc产生的碳青霉烯抗生素有利于病原菌在生存环境中竞争；蛋白酶为细菌蛋白的生物合成提供所用的氨基酸，并降解寄主产生的抗性相关蛋白；纤维素酶降解寄主的细胞壁；果胶酶是Pcc的最重要致病因子，分解并利用中间薄层和细胞壁中的果胶质，对组织进行瓦解，造成细胞质渗漏及细胞破坏，最终引起软腐病的发生。
本研究通过同源重组基因敲除技术，构建了rmsB基因的缺失突变体，并对得到的突变株进行致病相关的表型测定，通过相关生物学和致病性测定探索rsmB缺失突变体与Pcc致病性的关系。
材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株、质粒及培养条件 胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（Pcc）菌株PccS1， 由本实验室分离和鉴定[6]，实验所用其它菌株和质粒见表11。大肠杆菌菌株的培养使用LB培养基， 37 ℃培养。PccS1的培养使用LB培养基，28 ℃培养。两亲结合实验使用固体TY培养基。
表11 本研究所用菌株和质粒
Table 1 Strains and plasmids used in this study
菌株或质粒Strains/Plasmids
相关特性
Characteristics
来源
Source
Escherichia coli
DH5α
Φ80 lacZΔM15，(lacZYAargF)U169． recA1，endA1． thi1
Lab collection
S171λpir
λpir pro hsdR，recA
Lab collection
目录
摘要4
关键词4
Abstract4
Key words4
引言（或绪论）4
1材料与方法5
1.1材料 5
1.1.1供试菌株、质粒及培养条件5
1.1.2培养基5
1.1.3抗生素及抗生素浓度6
1.1.4菌株培养及保存6
1.1．5主要试剂和仪器6
1.1．6引物和限制性内切酶6
1.2缺失突变体的构建6
1.2.1质粒的提取6
1.2.2DNA的酶切7
1.2.3化学感受态细胞的制备7
1.2.4化学转化7
1.2.5 DNA片段的PCR扩增和纯化7
1.2.6两亲交配得到的突变缺失体8
1.3致病性的测定8
1.4相关生物学特性的测定8
1.4.1游动性测定8
1.4.2沉降性测定8
1.4.3生物膜活性测定8
1.5相关致病因子的测定9
1.5.1纤维素酶活性测定9
1.5.2蛋白酶活性测定9
1.5.3果胶酶活性测定9
1.5.4碳青霉烯抗生素9
2结果与分析9
2.1突变菌株的构建9
2.2致病性测定9
2.3生物学特性测定结果10
2.3.1游动性测定结果 10
2.3.2沉降性测定结果10
2.3.3生物膜测定结果10
2.3.4碳青 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
霉烯抗生素10
2.4致病相关因子测定结果11
2.4.1纤维素酶活性测定结果11
2.4.2果胶酶活性测定结果11
2.4.3蛋白酶活性测定结果11
3讨论11
致谢11
参考文献12
胡萝卜软腐果胶杆菌rsmB基因致病相关功能分析
引言
彩色马蹄莲(Zantedeschia spp.)是高档的单子叶观赏植物。侵染彩色马蹄莲的病原菌分为三类：病毒、真菌和细菌。其中，细菌性病害的细菌性软腐病的发生是彩色马蹄莲生产中的最大难题，所有彩色马蹄莲的杂交种都不同程度地感病[1]。引起此类病害的主要病原菌有：胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种(Pcc，1998年前为 Erwinia carotovora subsp. carotovora)、胡萝卜软腐果胶杆菌黑胫亚种(Pectobacterterium carotovorum subsp. atroseptica, 1998年前为 Erwinia carotovora subsp. atroseptica)和菊欧文氏菌(Dickeya dadantii,1998年前为 Erwinia chrysanthemi)[2~4]。其中胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种为我国细菌性软腐病的最主要病原细菌，可侵染多种寄主，包括十字花科、茄科、豆科、伞形科和葫芦科等多种蔬菜及多种观赏花卉植物[5~6]。
病原菌入侵植株并致使植物发病的过程其实质是病原菌与寄主发生相互作用的过程，Pcc在这一过程中产生了胞外水解酶、植物毒素和碳青霉烯抗生素等一系列致病因子[7~8]。胡萝卜软腐果胶杆菌的致病因子有生物膜、游动性、细胞壁降解酶（纤维素酶、蛋白酶、果胶酶）、脂多糖等。Pcc产生的碳青霉烯抗生素有利于病原菌在生存环境中竞争；蛋白酶为细菌蛋白的生物合成提供所用的氨基酸，并降解寄主产生的抗性相关蛋白；纤维素酶降解寄主的细胞壁；果胶酶是Pcc的最重要致病因子，分解并利用中间薄层和细胞壁中的果胶质，对组织进行瓦解，造成细胞质渗漏及细胞破坏，最终引起软腐病的发生。
本研究通过同源重组基因敲除技术，构建了rmsB基因的缺失突变体，并对得到的突变株进行致病相关的表型测定，通过相关生物学和致病性测定探索rsmB缺失突变体与Pcc致病性的关系。
材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株、质粒及培养条件 胡萝卜软腐果胶杆菌胡萝卜亚种（Pcc）菌株PccS1， 由本实验室分离和鉴定[6]，实验所用其它菌株和质粒见表11。大肠杆菌菌株的培养使用LB培养基， 37 ℃培养。PccS1的培养使用LB培养基，28 ℃培养。两亲结合实验使用固体TY培养基。
表11 本研究所用菌株和质粒
Table 1 Strains and plasmids used in this study
菌株或质粒Strains/Plasmids
相关特性
Characteristics
来源
Source
Escherichia coli
DH5α
Φ80 lacZΔM15，(lacZYAargF)U169． recA1，endA1． thi1
Lab collection
S171λpir
λpir pro hsdR，recA
Lab collection
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/nongxue/zwbh/148.html
