稻曲病菌产毒突变体tdna插入位点分析
摘要： 水稻稻曲病（false smut of rice）是由稻曲病菌［Ustilaginoidea virens (Cooke)Tak.］引起的水稻穗部真菌病害。近年来，由于矮秆紧凑型水稻品种、籼粳亚种间杂交稻组合的推广以及氮肥用量不断加大，稻曲病的发生日趋严重，稻曲病已从次要病害上升为主要病害。本研究通过人工注射接种致病验证突变体c1025、c1605、c1623和c1641的产毒能力；Southern 杂交分析外源基因插入的拷贝数；利用 HiTail-PCR 获得 T-DNA插入位点的侧翼序列。研究结果表明,与野生型菌株P1相比,4个突变菌株的毒素含量显著变化并且产毒能力保持稳定,Ｔ-ＤＮＡ在4个突变菌株中均以双拷贝形式插入。推测c1025产毒能力突变可能是由于T-DNA的插入在UV8b_2011和UV8b_2012基因之间影响了某些基因的正常表达。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
1前言2
1.1 稻曲病的发生、危害及其防治2
1.2 稻曲病菌的研究进展2
1.3 本次试验的研究意义3
2 实验材料 4
2.1 供试菌株4
2.2 供试水稻4
2.3 引物与主要试剂4
2.4 培养基4
2.5 主要仪器和设备5
3 实验方法 5
3.1 菌株产毒能力测定5
3.1.1 粗毒素的提取5
3.1.2 粗毒素的组分分析5
3.2 CTAB法提取稻曲病菌基因组DNA5
3.3 P1和突变菌株基因组中GFP和HPH的扩增6
3.4 Southern杂交6
3.4.1 地高辛标记探针7
3.4.2 基因组酶切反应7
3.4.3 电泳7
3.4.4 变性及中和8
3.4.5 转膜8
3.4.6 预杂交与杂交8
3.4.7 洗膜及显色8
3.5 突变菌株的侧翼序列扩克隆和分析9
4 结果与分析10
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
4.1 突变菌株的毒素检测 10
4.2 突变菌株的分子检测 10
4.3 突变菌株 TDNA 插入位点侧翼序列分析13
5 讨论16
致谢 17
参考文献 17
稻曲病菌产毒突变体TDNA插入位点分析
引言
1.前言
1.1 稻曲病的发生、危害及其防治
水稻稻曲病（false smut of rice）又称为黑穗病、绿黑穗病、谷花病、青粉病，俗称“丰产果”，是由稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）侵染引发的水稻穗部病害。稻曲病病原菌属子囊菌麦角科拟黑粉属,以菌核在地面越冬,也可以厚垣孢子在谷粒上越冬。子囊孢子和分生孢子均藉风雨侵入花器。稻曲病菌侵入花器,仅稻穗的个别谷粒受害,在颖壳合缝处先露出淡黄绿色的小菌块,后膨大如球,包裹全颖壳成墨绿色,最后龟裂,散出墨绿色粉末,碾在米中,影响商品质量。
随着优质高产水稻的大面积推广和施肥水平的相应提高，稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）侵染引起的稻曲病已成为中国水稻主要病害之一。20082011 年期间，稻曲病仅在江苏省发病面已经高达 1000 万亩以上，约占江苏省水稻栽培面积的 30%；2013 年江苏省稻曲病防治面积达到 2600 万亩[1,2]。稻曲病不仅影响水稻的产量、品质，其病原菌危害水稻穗部后，形成含有暗绿色或黑色厚垣孢子的稻曲球，产生对人、动物和植物的细胞分裂具有强烈抑制作用的毒素（ustiloxins），严重影响稻米品质[3]。
对稻曲病的防治主要集中在“防”上。一是稻曲病在发病前期无症状表现;二是防治技术要求高,需要把握水稻的生育期。所以在稻曲病的防治上各地均釆取预防为主、综合防治的策略,其中又以农业防治为基础、以化学预防和生物防治为辅。农业防治需注意选择推广抗病、耐病品种，改进栽培制度，注意施肥量、施肥时期及田间管理，化学防治需选好有效的药剂及防治花期，做好种子消毒,而生物防治也渐渐变成热点, 利用生物防治即微生物代谢产物(农用抗生素)或者微生物活菌制剂防治植物病害,可以弥补化学农药的一些缺陷,不污染环境安全无残留,进行生物防治可能是未来防治的一种发展趋势。
1.2 稻曲病菌的研究进展
1878年库克首先从印度获得稻曲病病原菌的真菌标本,并定名为Ustilago virens，1896年Takaheshi经过研究,将其命名为Ustilaginoidea virens (Cooke)Tak.并沿用至今．随着稻曲病菌有性态的发现,其命名更加详细:无性世代为Ustilaginoidea virens,属半知菌亚门,可产生厚垣孢子和分生孢子;有性世代为Villosiclava virens,分类上属于子囊菌亚门类壳菌纲肉座菌目麦角菌科属,可形成子座、子囊和子囊孢子。
稻曲病菌以厚垣孢子附着于种子表面和落入田间越冬,也可以菌核在土壤中越冬, 翌年水稻孕穗至抽穗灌浆期, 在适宜的温度,湿度条件下, 菌核萌发形成子座,形成子囊壳,释放子囊孢子,可再萌发产生分生孢子,厚垣孢子也可萌发产生分生孢子, 分生孢子亦可再萌发产生次生分生孢子[4]。由于三种孢子都有人工接种水稻并致病的报道，因此很多学者认为它们都可能是初侵染源，但明确稻曲病菌在自然条件下的初侵染源还有待深入调研。
无性阶段是在分生孢子座上形成厚壁的分生孢子,即厚垣孢子(chlamydospore)。厚壁孢子侧生在分生孢子座内放射状菌丝上,具柄,`单胞,球形或椭圆形,具刺,橄榄色,表而有疵突,直径为45μm。白色稻曲球上的厚壁分生孢子球形,无色透明,外壁光滑。未成熟的厚垣孢子较小,光滑且透明。
稻曲病有性阶段为由菌核萌发形成有性子座、子囊和子囊孢子。分生孢子散发后,在抱子座上很易看到菌核。一个孢子座一般形成15个菌核,菌核易于脱落,质地较硬,呈黑褐色,扁平状、球形或椭圆形,大小不一。菌核萌发形成一到数个有柄头状子座,子座增大,变为黄绿色的球形瘤状突起,直径为135μm。在68个子座中,只有35个能形成带有子囊壳的成熟子座。
国内外对稻曲病菌毒素的研究 [4]多集中在对动植物毒性[5]、化学合成[6]、检测分析[7,8,9,]等方面，还存在很多问题值得进一步探讨，如稻曲病病原菌毒素生物合成途径、代谢调控、相关基因的克隆；稻曲毒素在病原菌致病过程中的作用[10]，致病过程中病原菌分泌稻曲毒素行为；稻曲病病原菌毒素快速检测技术研究，稻曲病病原菌毒素引起的食品安全风险预警及评估等。
1.3 本次试验的研究意义
稻曲病菌的次生代谢会产生稻曲病菌毒素，该毒素是一类具有阻断真核细胞有丝分裂活性的环肽毒素，具有较强的细胞毒性。早在1915年就有报道发现稻曲病菌的冰提取物对兔有毒。Suwa[11]报道了稻曲球水浸液对兔子的毒害作用。19331937年Yabuta等首先从稻曲病的乙醚提取物分离到一种色素叫做Ustilaginoidin。Shibata等确定了这种化合物的结构及其同源物,发现这些化合物作用机理和植物毒素及真菌毒素的作用机理不同。我国植病学家朱凤美在50年代便指出稻曲病含有C9H6O7有毒色素,后经研究发现此毒素是一种生物碱。日本学者研究发现稻曲病菌毒素Ustiloxins是类抗真核细胞有丝分裂的环形肽[6]。稻曲球中含有的稻曲菌素更能强烈抑制微管蛋白组装，干扰细胞骨架形成，引起人畜病变, 因此，研究和解析稻曲病菌毒素的合成过程，对有效控制稻曲病的发生，稳定粮食安全具有重要意义,成为粮食生产突出问题[12,13]。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
1前言2
1.1 稻曲病的发生、危害及其防治2
1.2 稻曲病菌的研究进展2
1.3 本次试验的研究意义3
2 实验材料 4
2.1 供试菌株4
2.2 供试水稻4
2.3 引物与主要试剂4
2.4 培养基4
2.5 主要仪器和设备5
3 实验方法 5
3.1 菌株产毒能力测定5
3.1.1 粗毒素的提取5
3.1.2 粗毒素的组分分析5
3.2 CTAB法提取稻曲病菌基因组DNA5
3.3 P1和突变菌株基因组中GFP和HPH的扩增6
3.4 Southern杂交6
3.4.1 地高辛标记探针7
3.4.2 基因组酶切反应7
3.4.3 电泳7
3.4.4 变性及中和8
3.4.5 转膜8
3.4.6 预杂交与杂交8
3.4.7 洗膜及显色8
3.5 突变菌株的侧翼序列扩克隆和分析9
4 结果与分析10
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
4.1 突变菌株的毒素检测 10
4.2 突变菌株的分子检测 10
4.3 突变菌株 TDNA 插入位点侧翼序列分析13
5 讨论16
致谢 17
参考文献 17
稻曲病菌产毒突变体TDNA插入位点分析
引言
1.前言
1.1 稻曲病的发生、危害及其防治
水稻稻曲病（false smut of rice）又称为黑穗病、绿黑穗病、谷花病、青粉病，俗称“丰产果”，是由稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）侵染引发的水稻穗部病害。稻曲病病原菌属子囊菌麦角科拟黑粉属,以菌核在地面越冬,也可以厚垣孢子在谷粒上越冬。子囊孢子和分生孢子均藉风雨侵入花器。稻曲病菌侵入花器,仅稻穗的个别谷粒受害,在颖壳合缝处先露出淡黄绿色的小菌块,后膨大如球,包裹全颖壳成墨绿色,最后龟裂,散出墨绿色粉末,碾在米中,影响商品质量。
随着优质高产水稻的大面积推广和施肥水平的相应提高，稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）侵染引起的稻曲病已成为中国水稻主要病害之一。20082011 年期间，稻曲病仅在江苏省发病面已经高达 1000 万亩以上，约占江苏省水稻栽培面积的 30%；2013 年江苏省稻曲病防治面积达到 2600 万亩[1,2]。稻曲病不仅影响水稻的产量、品质，其病原菌危害水稻穗部后，形成含有暗绿色或黑色厚垣孢子的稻曲球，产生对人、动物和植物的细胞分裂具有强烈抑制作用的毒素（ustiloxins），严重影响稻米品质[3]。
对稻曲病的防治主要集中在“防”上。一是稻曲病在发病前期无症状表现;二是防治技术要求高,需要把握水稻的生育期。所以在稻曲病的防治上各地均釆取预防为主、综合防治的策略,其中又以农业防治为基础、以化学预防和生物防治为辅。农业防治需注意选择推广抗病、耐病品种，改进栽培制度，注意施肥量、施肥时期及田间管理，化学防治需选好有效的药剂及防治花期，做好种子消毒,而生物防治也渐渐变成热点, 利用生物防治即微生物代谢产物(农用抗生素)或者微生物活菌制剂防治植物病害,可以弥补化学农药的一些缺陷,不污染环境安全无残留,进行生物防治可能是未来防治的一种发展趋势。
1.2 稻曲病菌的研究进展
1878年库克首先从印度获得稻曲病病原菌的真菌标本,并定名为Ustilago virens，1896年Takaheshi经过研究,将其命名为Ustilaginoidea virens (Cooke)Tak.并沿用至今．随着稻曲病菌有性态的发现,其命名更加详细:无性世代为Ustilaginoidea virens,属半知菌亚门,可产生厚垣孢子和分生孢子;有性世代为Villosiclava virens,分类上属于子囊菌亚门类壳菌纲肉座菌目麦角菌科属,可形成子座、子囊和子囊孢子。
稻曲病菌以厚垣孢子附着于种子表面和落入田间越冬,也可以菌核在土壤中越冬, 翌年水稻孕穗至抽穗灌浆期, 在适宜的温度,湿度条件下, 菌核萌发形成子座,形成子囊壳,释放子囊孢子,可再萌发产生分生孢子,厚垣孢子也可萌发产生分生孢子, 分生孢子亦可再萌发产生次生分生孢子[4]。由于三种孢子都有人工接种水稻并致病的报道，因此很多学者认为它们都可能是初侵染源，但明确稻曲病菌在自然条件下的初侵染源还有待深入调研。
无性阶段是在分生孢子座上形成厚壁的分生孢子,即厚垣孢子(chlamydospore)。厚壁孢子侧生在分生孢子座内放射状菌丝上,具柄,`单胞,球形或椭圆形,具刺,橄榄色,表而有疵突,直径为45μm。白色稻曲球上的厚壁分生孢子球形,无色透明,外壁光滑。未成熟的厚垣孢子较小,光滑且透明。
稻曲病有性阶段为由菌核萌发形成有性子座、子囊和子囊孢子。分生孢子散发后,在抱子座上很易看到菌核。一个孢子座一般形成15个菌核,菌核易于脱落,质地较硬,呈黑褐色,扁平状、球形或椭圆形,大小不一。菌核萌发形成一到数个有柄头状子座,子座增大,变为黄绿色的球形瘤状突起,直径为135μm。在68个子座中,只有35个能形成带有子囊壳的成熟子座。
国内外对稻曲病菌毒素的研究 [4]多集中在对动植物毒性[5]、化学合成[6]、检测分析[7,8,9,]等方面，还存在很多问题值得进一步探讨，如稻曲病病原菌毒素生物合成途径、代谢调控、相关基因的克隆；稻曲毒素在病原菌致病过程中的作用[10]，致病过程中病原菌分泌稻曲毒素行为；稻曲病病原菌毒素快速检测技术研究，稻曲病病原菌毒素引起的食品安全风险预警及评估等。
1.3 本次试验的研究意义
稻曲病菌的次生代谢会产生稻曲病菌毒素，该毒素是一类具有阻断真核细胞有丝分裂活性的环肽毒素，具有较强的细胞毒性。早在1915年就有报道发现稻曲病菌的冰提取物对兔有毒。Suwa[11]报道了稻曲球水浸液对兔子的毒害作用。19331937年Yabuta等首先从稻曲病的乙醚提取物分离到一种色素叫做Ustilaginoidin。Shibata等确定了这种化合物的结构及其同源物,发现这些化合物作用机理和植物毒素及真菌毒素的作用机理不同。我国植病学家朱凤美在50年代便指出稻曲病含有C9H6O7有毒色素,后经研究发现此毒素是一种生物碱。日本学者研究发现稻曲病菌毒素Ustiloxins是类抗真核细胞有丝分裂的环形肽[6]。稻曲球中含有的稻曲菌素更能强烈抑制微管蛋白组装，干扰细胞骨架形成，引起人畜病变, 因此，研究和解析稻曲病菌毒素的合成过程，对有效控制稻曲病的发生，稳定粮食安全具有重要意义,成为粮食生产突出问题[12,13]。
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