胞内共生菌wolbachia对灰飞虱种群适合度的影响
摘要：Wolbachia是广泛存在于节肢动物体内的一类母系遗传的共生细菌，可以通过不同方式操纵寄主的生殖行为，包括诱导胞质不亲和、诱导孤雌生殖、诱导雌性化和杀雄等。不同株系的Wolbachia对宿主的适合度会产生不同程度的影响。本实验以自然感染Wolbachia株系wStri的南京种群灰飞虱为实验材料，从发育历期、成虫寿命和产卵量三个方面评估Wolbachia株系wStri对灰飞虱适合度的影响。研究结果表明，Wolbachia株系wStri对灰飞虱成虫寿命并没有影响，但一定程度上缩短了低龄若虫发育时间，并且显著提高灰飞虱雌虫的产卵量。Wolbachia株系wStri对灰飞虱适合度影响的研究为后期揭示Wolbachia株系wStri调控寄主生殖行为的分子机制奠定了基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1 供试材料与饲养方法 2
1.2 检测感染与不感染品系 2
1.2.1 灰飞虱总DNA的提取2
1.2.2 PCR检测3
1.2.3 序列测定4
1.3 发育历期的测定4
1.4 成虫寿命的测定4
1.5 产卵量的测定4
2 结果与分析 4
2.1 灰飞虱体内Wolbachia检测结果 4
2.2 Wolbachia对灰飞虱发育历期的影响 5
2.3 Wolbachia对灰飞虱成虫寿命的影响 6
2.4 Wolbachia对灰飞虱产卵量的影响 7
3 讨论8
致谢8
参考文献9
胞内共生菌Wolbachia对灰飞虱种群适合度的影响
引言
Wolbachia是一类通过细胞质遗传的革兰氏阴性的专性内共生菌[1]， Wolbachia广泛分布于节肢动物门及线虫动物门，估计近66%的昆虫物种感染[2]，是目前为止昆虫中分布最广泛的胞内共生菌。Wolbachia作为一种胞内共生菌，能具有如此广泛的分布寄主，很大程度上
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
是由于其特殊的传播方式，包括：垂直传播和水平传播。垂直传播是Wolbachia在宿主种内的基本传递模式，以卵母细胞垂直传递的方式直接传给子代。水平传播是指Wolbachia在同种宿主的不同的个体之间传播。有研究表明，Wolbachia能在同种寄主不同个体间，以及不同种的寄主间进行横向传播(水平传播)。Wolbachia经过长期的进化过程形成的这两种传播机制使其达到在寄主种群中迅速扩散的目的。
Wolbachia与寄主之间的相互关系一直备受关注。研究表明大多数Wolbachia对寄主具有生殖调控作用。自上世纪七十年代开始，大量研究发现Wolbachia对寄主的生殖调控作用方式多样，包括诱导胞质不亲和（cytoplasmic incompatibility，CI）[3,4]、雌性化（feminization）[6]、孤雌生殖（parthenogenesis）[7,8]和杀雄作用（malemaking）[912]等。此外，Wolbachia还可以影响其适合度、调控免疫基因的表达、参与寄主的营养代谢等。生物适合度又称生存适合度，包括生活力和繁殖力，即主要指生物在生存环境中能生存并把它的特性传给下一代的相对能力。生活力一般以成活率、寿命、生长发育速度表示；繁殖力则以产生后代的数量表示[13]。近年来的一些研究表明，部分Wolbachia株系除了具有调控节肢动物宿主生殖的作用外，对宿主种群繁殖力也存在不同程度的影响。研究表明，某些Wolbachia株系能够增强节肢动物雌性寄主的生殖力，例如发现Wolbachia可提高宿主灰飞虱的生殖力[14]。同时发现部分Wolbachia株系能够提高节肢动物雄性宿主的生育能力，例如突眼蝇的雄性个体在去除掉Wolbachia后，生育力显著下降[15]。另外，Wolbachia除了能够对宿主生物学直接产生影响外，也可能对宿主种群产生生态学影响。通过对外来生物在入侵地和原产地Wolbachia感染率的比较，表明共生菌可能是一些外来生物种群在原产地增长的限制因子[16]。
灰飞虱[Laodelphax striatellus (Fallén)]属半翅目，飞虱科。广泛分布于我国各地，以长江流域及北方稻区发生较多。主要为害早、中稻秧田和本田分蘖期的稻苗。除以成虫、若虫刺吸危害外，还传播病毒病害。如在华东主要传播水稻黑条矮缩病和条纹叶枯病，在华北和西北主要传播小麦丛矮病和玉米矮缩病。其传毒危害所造成的损失远大于直接刺吸为害。2000年以来，由灰飞虱传播的水稻条纹叶枯病在江淮稻区发生日益严重，是江苏省1999年以来最为严重的水稻病害之一，20002003年生产上每年都出现发病率在50%以上甚至绝收的重病田，给江苏水稻安全生产和农民生计带来了重大影响[17]。据报道，灰飞虱体内的Wolbachia能够引起完全CI作用，即当感染的雄虫与不感染的雌虫交配后，后代完全不孵化，这也是野外种群灰飞虱感染率达到100%的重要原因之一。虽然很多学者已经发现Wolbachia对宿主的适合度有负面影响，但目前对于灰飞虱的研究还较少。Wolbachia对灰飞虱适合度影响的研究，不仅对于认识其生物学具有重要意义，而且为灰飞虱及其所携带的病害防治提供了新的思路。
1 材料与方法
1．1 供试材料及饲养方法
本实验以实验室经多代饲养的南京种群灰飞虱为供试虫源，用敏感品系TN1水稻进行饲养。具体方法为：先用清水漂洗去稻种中的瘪种病种并淘洗干净，在1000 mL的玻璃烧杯底部放一块圆形海绵（厚度约为8 mm），用水稻营养液浸湿海绵后，将漂洗好的水稻种均匀撒满（不宜过密）后用透气纱布封好杯口以免成虫飞入。每日观察稻苗的生长情况，并根据具体情况添加水稻营养液，待稻苗长至三分之二玻璃杯高度时即可用于饲养灰飞虱。将灰飞虱接入后，改加水稻营养液为加水，防止稻苗生长过快。当发现玻璃杯中稻苗有发霉或者大量枯黄现象时应及时更换新苗，换苗时只要将灰飞虱拍入新的稻苗即可。饲养条件为温度25 ± 1 ℃，相对湿度60%，昼夜交替频率为白天16 h晚上8 h。
1．2 检测感染与不感染品系
由于Wolbachia在灰飞虱种群中垂直传播效率非常高，所以只要把一对灰飞虱隔离起来饲养，检测雌虫Wolbachia的感染情况，如果是感染的，那么它的后代F1代就是100%感染的。这样把所有的F1代聚集起来就是100%感染品系的灰飞虱。
用浓度为0.1%的四环素浸泡已经发芽的稻苗于烧杯中24 h,然后从自然种群中挑取成虫或若虫分别放在处理好的烧杯中，让其生长。以后每日向烧杯中加入0.1%的四环素以保持海绵中四环素的浓度，用这种方法连续培养13代后再次测定其Wolbachia 感染情况，完全不感染Wolbachia的灰飞虱后代留作不感染品系。
由于实验室已进行过筛选并多代饲养，所以本实验只需要在实验前对其感染性进行检测即可。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1 供试材料与饲养方法 2
1.2 检测感染与不感染品系 2
1.2.1 灰飞虱总DNA的提取2
1.2.2 PCR检测3
1.2.3 序列测定4
1.3 发育历期的测定4
1.4 成虫寿命的测定4
1.5 产卵量的测定4
2 结果与分析 4
2.1 灰飞虱体内Wolbachia检测结果 4
2.2 Wolbachia对灰飞虱发育历期的影响 5
2.3 Wolbachia对灰飞虱成虫寿命的影响 6
2.4 Wolbachia对灰飞虱产卵量的影响 7
3 讨论8
致谢8
参考文献9
胞内共生菌Wolbachia对灰飞虱种群适合度的影响
引言
Wolbachia是一类通过细胞质遗传的革兰氏阴性的专性内共生菌[1]， Wolbachia广泛分布于节肢动物门及线虫动物门，估计近66%的昆虫物种感染[2]，是目前为止昆虫中分布最广泛的胞内共生菌。Wolbachia作为一种胞内共生菌，能具有如此广泛的分布寄主，很大程度上
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
是由于其特殊的传播方式，包括：垂直传播和水平传播。垂直传播是Wolbachia在宿主种内的基本传递模式，以卵母细胞垂直传递的方式直接传给子代。水平传播是指Wolbachia在同种宿主的不同的个体之间传播。有研究表明，Wolbachia能在同种寄主不同个体间，以及不同种的寄主间进行横向传播(水平传播)。Wolbachia经过长期的进化过程形成的这两种传播机制使其达到在寄主种群中迅速扩散的目的。
Wolbachia与寄主之间的相互关系一直备受关注。研究表明大多数Wolbachia对寄主具有生殖调控作用。自上世纪七十年代开始，大量研究发现Wolbachia对寄主的生殖调控作用方式多样，包括诱导胞质不亲和（cytoplasmic incompatibility，CI）[3,4]、雌性化（feminization）[6]、孤雌生殖（parthenogenesis）[7,8]和杀雄作用（malemaking）[912]等。此外，Wolbachia还可以影响其适合度、调控免疫基因的表达、参与寄主的营养代谢等。生物适合度又称生存适合度，包括生活力和繁殖力，即主要指生物在生存环境中能生存并把它的特性传给下一代的相对能力。生活力一般以成活率、寿命、生长发育速度表示；繁殖力则以产生后代的数量表示[13]。近年来的一些研究表明，部分Wolbachia株系除了具有调控节肢动物宿主生殖的作用外，对宿主种群繁殖力也存在不同程度的影响。研究表明，某些Wolbachia株系能够增强节肢动物雌性寄主的生殖力，例如发现Wolbachia可提高宿主灰飞虱的生殖力[14]。同时发现部分Wolbachia株系能够提高节肢动物雄性宿主的生育能力，例如突眼蝇的雄性个体在去除掉Wolbachia后，生育力显著下降[15]。另外，Wolbachia除了能够对宿主生物学直接产生影响外，也可能对宿主种群产生生态学影响。通过对外来生物在入侵地和原产地Wolbachia感染率的比较，表明共生菌可能是一些外来生物种群在原产地增长的限制因子[16]。
灰飞虱[Laodelphax striatellus (Fallén)]属半翅目，飞虱科。广泛分布于我国各地，以长江流域及北方稻区发生较多。主要为害早、中稻秧田和本田分蘖期的稻苗。除以成虫、若虫刺吸危害外，还传播病毒病害。如在华东主要传播水稻黑条矮缩病和条纹叶枯病，在华北和西北主要传播小麦丛矮病和玉米矮缩病。其传毒危害所造成的损失远大于直接刺吸为害。2000年以来，由灰飞虱传播的水稻条纹叶枯病在江淮稻区发生日益严重，是江苏省1999年以来最为严重的水稻病害之一，20002003年生产上每年都出现发病率在50%以上甚至绝收的重病田，给江苏水稻安全生产和农民生计带来了重大影响[17]。据报道，灰飞虱体内的Wolbachia能够引起完全CI作用，即当感染的雄虫与不感染的雌虫交配后，后代完全不孵化，这也是野外种群灰飞虱感染率达到100%的重要原因之一。虽然很多学者已经发现Wolbachia对宿主的适合度有负面影响，但目前对于灰飞虱的研究还较少。Wolbachia对灰飞虱适合度影响的研究，不仅对于认识其生物学具有重要意义，而且为灰飞虱及其所携带的病害防治提供了新的思路。
1 材料与方法
1．1 供试材料及饲养方法
本实验以实验室经多代饲养的南京种群灰飞虱为供试虫源，用敏感品系TN1水稻进行饲养。具体方法为：先用清水漂洗去稻种中的瘪种病种并淘洗干净，在1000 mL的玻璃烧杯底部放一块圆形海绵（厚度约为8 mm），用水稻营养液浸湿海绵后，将漂洗好的水稻种均匀撒满（不宜过密）后用透气纱布封好杯口以免成虫飞入。每日观察稻苗的生长情况，并根据具体情况添加水稻营养液，待稻苗长至三分之二玻璃杯高度时即可用于饲养灰飞虱。将灰飞虱接入后，改加水稻营养液为加水，防止稻苗生长过快。当发现玻璃杯中稻苗有发霉或者大量枯黄现象时应及时更换新苗，换苗时只要将灰飞虱拍入新的稻苗即可。饲养条件为温度25 ± 1 ℃，相对湿度60%，昼夜交替频率为白天16 h晚上8 h。
1．2 检测感染与不感染品系
由于Wolbachia在灰飞虱种群中垂直传播效率非常高，所以只要把一对灰飞虱隔离起来饲养，检测雌虫Wolbachia的感染情况，如果是感染的，那么它的后代F1代就是100%感染的。这样把所有的F1代聚集起来就是100%感染品系的灰飞虱。
用浓度为0.1%的四环素浸泡已经发芽的稻苗于烧杯中24 h,然后从自然种群中挑取成虫或若虫分别放在处理好的烧杯中，让其生长。以后每日向烧杯中加入0.1%的四环素以保持海绵中四环素的浓度，用这种方法连续培养13代后再次测定其Wolbachia 感染情况，完全不感染Wolbachia的灰飞虱后代留作不感染品系。
由于实验室已进行过筛选并多代饲养，所以本实验只需要在实验前对其感染性进行检测即可。
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