番茄斑萎病毒抗性基因sw5b的的结构与功能研究
摘要：本文通过将番茄斑萎病毒抗性基因Sw-5b全长及每个功能域分别构建到荧光表达载体上，观察定位，然后加上核定位标签和和输出输入标签，分别通过农杆菌介导瞬时表达和转基因鉴定抗病性差异，来验证其定位和功能的关系。结果表明，Sw-5b是定位在细胞质和细胞核，加上进核标签后HR反应微弱，加上出核标签HR反应与野生型无明显差异，转基因定性表达有相同的反应，证明Sw-5b的功能域是定位在细胞质上的，改变定位会影响其功能的表达。
目录
摘要1
关键词1
Abstract 1
Key words 1
引言1
材料与方法2
1.1实验材料2
1.1.1植物材料2
1.1.2质粒材料2
1.2实验方法3
1.2.1 YFPSw5b构建3
1.2.2 进出核载体构建3
1.2.3 HR反应3
1.2.4 共聚焦3
1.2.5转基因3
2 结果与分析 4
2.1 Sw5b的结构4
2.2 Sw5b的定位4
2.3 HR反应5
2.4共聚焦观察5
2.5 转基因6
3 讨论 8
致谢9
参考文献9
番茄斑萎病毒抗性基因Sw5b的结构与功能研究
引言
番茄斑萎病毒最初是1919年在澳洲发现于番茄，Brillelebank将此病命名为斑萎病（Spotted wilt）[1]。番茄斑萎病毒在大丽菊首次发现后，相继从青椒、 番茄及许多其他观赏植物分离出该病毒[2]。番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）是一种危害农业生产的重要病毒，在十大最具危害性的病毒中排行第二[3]。番茄斑萎病毒属于布尼亚病毒科（Bunyaviridae）番茄斑萎病毒属（Tospovirus），寄主植物非常广泛，可侵染 84 个科 1 090 种植物。1941年前后TSWV成为影响欧洲烟草种植者经济收入的一种重要病毒[4]。在欧洲、北美、南美、亚洲和大洋洲等多个国家和地区广泛分布，属于欧洲及地中海
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
植物保护组织（EPPO）A2类检疫性有害生物，同时也是中国进境植物检疫性有害生物。番茄斑萎病毒病对番茄的影响最大，虽然是我国进境禁止携带的有害生物之一，但在一些省份已经发生，且有加重趋势。目前，番茄斑萎病毒病在我国云南省、广西省均有报道发生且发病造成的损失严重[5]，亟待有效的防治措施控制该病害的爆发。选用抗病品种是有效的防治方法，目前尚末育出抗TSWV的专用品种。其次防治蓟马，番茄苗期和定植后防治媒介昆虫－蓟马。但是利用化学药剂防治不仅易造成环境污染而且会造成抗药性的出现[6]。因此，从分子水平上了解抗病基因SW5b的抗病机制，对于培育抗病品种，综合防治番茄斑萎病毒病具有重要的理论指导意义。
抗病基因SW5是 Sergio H. Brommonschenkel[7]等人利用图位克隆从番茄中克隆得到，含有 Sw5 的番茄可以限制病毒在体内的广泛传播，仅表现为轻微的过敏性反应。Sw5 位于 9 号染色体长臂端粒区域。Sw5 与 Mi（抗根结线虫基因）、RPM1（抗假单胞菌基因）同属于一类抗性基因，均为 CC（NBARC）LRR 结构，富含亮氨酸重复和一个高度保守的核苷酸结合位点。van Zijl和 Stevens 等已将 Sw5 转育到栽培番茄品种Stevens 中。SW5b已被鉴定是具有功能的基因拷贝，能抗番茄班委病毒，据蛋白预测表明SW5是细胞质蛋白，具有核酸结合位点（NBS）结构域和C末端的LRR序列[8]，所以SW5属于NBSLRR家族抗病基因，该基因家族包括番茄的Mi、I2和Prf基因[8]；拟南芥的RPM1基因和马铃薯X病毒的抗性基因Rx等。其中SW5和Mi具有一定的相似性，这表明在番茄中SW5和Mi也许共享或具有相似的抗病毒和抗线虫信号通路。 通过借助本氏烟表达系统结合大麦中的抗病功能研究，结果表明细胞核内MLA10足以限制大麦白粉菌的生长，但不引发细胞死亡；而细胞质中的MLA10能够引发细胞死亡。该研究揭示了MLA10介导细胞死亡信号与抗病信号的亚细胞功能分区，并提出抗病蛋白可能通过整合来自不同亚细胞区域的多种抗病信号途径，最终达到抗病的目的。
本文主要是将SW5b全长及每个功能域分别构建到荧光表达载体上，观察定位，然后加上核定位标签和和输出输入标签，分别通过农杆菌介导瞬时表达和转基因鉴定抗病性差异，来验证其定位和功能的关系。
1.材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1植物材料
本氏烟在16h光照8h黑暗温度24±1℃条件的温室栽培
1.1.2质粒材料
1.1.2.1构建YFPSw5b质粒材料
引物1:：PV953
YFPKpnIF
GGGGTACCatggtgagcaagggcgagg
引物2：PV954
YFP without stop codonR
agatctgtacagctcgtcca
引物3：PV955
Sw5b:YFP fusionF
tggacgagctgtacagatctAtggctgaaaatgaaattgag
引物4：PV956
Sw5b_245264R
Cctttctagattaaggttag
1.1.2.2构建进出核质粒材料
编号
蛋白标签
标签蛋白序列
引物序列
(
NES
NELALKLAGLDINK
引物
①GGGGTACCATGGCTAACGAGTTGGCTTTGAAGTTGG
引物②CGAGTTGGCTTTGAAGTTGGCTGGATTGGATATCAACAAGatggtgagcaagggcg
(
nes
NELALKAAGADANK
引物①CGAGTTGGCTTTGAAGGCGGCTGGAGC0GATGCCAACAAGatggtgagcaagggcgagg
引物②GGGGTACCATGGCTAACGAGTTGGCTTTGAAGGCGG
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目录
摘要1
关键词1
Abstract 1
Key words 1
引言1
材料与方法2
1.1实验材料2
1.1.1植物材料2
1.1.2质粒材料2
1.2实验方法3
1.2.1 YFPSw5b构建3
1.2.2 进出核载体构建3
1.2.3 HR反应3
1.2.4 共聚焦3
1.2.5转基因3
2 结果与分析 4
2.1 Sw5b的结构4
2.2 Sw5b的定位4
2.3 HR反应5
2.4共聚焦观察5
2.5 转基因6
3 讨论 8
致谢9
参考文献9
番茄斑萎病毒抗性基因Sw5b的结构与功能研究
引言
番茄斑萎病毒最初是1919年在澳洲发现于番茄，Brillelebank将此病命名为斑萎病（Spotted wilt）[1]。番茄斑萎病毒在大丽菊首次发现后，相继从青椒、 番茄及许多其他观赏植物分离出该病毒[2]。番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus，TSWV）是一种危害农业生产的重要病毒，在十大最具危害性的病毒中排行第二[3]。番茄斑萎病毒属于布尼亚病毒科（Bunyaviridae）番茄斑萎病毒属（Tospovirus），寄主植物非常广泛，可侵染 84 个科 1 090 种植物。1941年前后TSWV成为影响欧洲烟草种植者经济收入的一种重要病毒[4]。在欧洲、北美、南美、亚洲和大洋洲等多个国家和地区广泛分布，属于欧洲及地中海
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植物保护组织（EPPO）A2类检疫性有害生物，同时也是中国进境植物检疫性有害生物。番茄斑萎病毒病对番茄的影响最大，虽然是我国进境禁止携带的有害生物之一，但在一些省份已经发生，且有加重趋势。目前，番茄斑萎病毒病在我国云南省、广西省均有报道发生且发病造成的损失严重[5]，亟待有效的防治措施控制该病害的爆发。选用抗病品种是有效的防治方法，目前尚末育出抗TSWV的专用品种。其次防治蓟马，番茄苗期和定植后防治媒介昆虫－蓟马。但是利用化学药剂防治不仅易造成环境污染而且会造成抗药性的出现[6]。因此，从分子水平上了解抗病基因SW5b的抗病机制，对于培育抗病品种，综合防治番茄斑萎病毒病具有重要的理论指导意义。
抗病基因SW5是 Sergio H. Brommonschenkel[7]等人利用图位克隆从番茄中克隆得到，含有 Sw5 的番茄可以限制病毒在体内的广泛传播，仅表现为轻微的过敏性反应。Sw5 位于 9 号染色体长臂端粒区域。Sw5 与 Mi（抗根结线虫基因）、RPM1（抗假单胞菌基因）同属于一类抗性基因，均为 CC（NBARC）LRR 结构，富含亮氨酸重复和一个高度保守的核苷酸结合位点。van Zijl和 Stevens 等已将 Sw5 转育到栽培番茄品种Stevens 中。SW5b已被鉴定是具有功能的基因拷贝，能抗番茄班委病毒，据蛋白预测表明SW5是细胞质蛋白，具有核酸结合位点（NBS）结构域和C末端的LRR序列[8]，所以SW5属于NBSLRR家族抗病基因，该基因家族包括番茄的Mi、I2和Prf基因[8]；拟南芥的RPM1基因和马铃薯X病毒的抗性基因Rx等。其中SW5和Mi具有一定的相似性，这表明在番茄中SW5和Mi也许共享或具有相似的抗病毒和抗线虫信号通路。 通过借助本氏烟表达系统结合大麦中的抗病功能研究，结果表明细胞核内MLA10足以限制大麦白粉菌的生长，但不引发细胞死亡；而细胞质中的MLA10能够引发细胞死亡。该研究揭示了MLA10介导细胞死亡信号与抗病信号的亚细胞功能分区，并提出抗病蛋白可能通过整合来自不同亚细胞区域的多种抗病信号途径，最终达到抗病的目的。
本文主要是将SW5b全长及每个功能域分别构建到荧光表达载体上，观察定位，然后加上核定位标签和和输出输入标签，分别通过农杆菌介导瞬时表达和转基因鉴定抗病性差异，来验证其定位和功能的关系。
1.材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1植物材料
本氏烟在16h光照8h黑暗温度24±1℃条件的温室栽培
1.1.2质粒材料
1.1.2.1构建YFPSw5b质粒材料
引物1:：PV953
YFPKpnIF
GGGGTACCatggtgagcaagggcgagg
引物2：PV954
YFP without stop codonR
agatctgtacagctcgtcca
引物3：PV955
Sw5b:YFP fusionF
tggacgagctgtacagatctAtggctgaaaatgaaattgag
引物4：PV956
Sw5b_245264R
Cctttctagattaaggttag
1.1.2.2构建进出核质粒材料
编号
蛋白标签
标签蛋白序列
引物序列
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引物
①GGGGTACCATGGCTAACGAGTTGGCTTTGAAGTTGG
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引物②Cctttctagattaaggttag
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