拟南芥精细胞特异表达lcr小肽的功能分析
双受精过程是被子植物孢子体与配子体世代转换的重要过程，起始于花粉管萌发，以精细胞与卵细胞和中央细胞融合为终点。其中，小肽作为重要的信号分子参与双受精过程的各个阶段。本实验以拟南芥为材料，基于RNA-seq数据，找到精细胞特异表达的四个LCR基因，同时选取与其具有最近同源性且在雄性特异高表达的另外四个LCR基因加以研究。目前已获得部分基因的GUS染色和GFP荧光信号定位数据，发现其在雄性组织特异表达而无精细胞特异定位，且通过T-DNA插入以及CRISPR/Cas9 系统获得的突变体中，尚未发现明显生殖异常。通过对精细胞特异基因的研究，希望能够更清楚阐述雌雄配子融合机制。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料与方法6
1.1材料 6
1.2方法 7
1.2.1基于Gateway方法构建载体7
1.2.2CRISPR构建突变体7
1.2.3热激转大肠杆菌8
1.2.4电击转农杆菌8
1.2.5农杆菌转化拟南芥9
1.2.6组织GUS染色观察9
1.2.7花粉粒GFP荧光观察9
1.2.8花粉管体外及半体内萌发9
2结果与分析9
2.1 LCR基因克隆以及载体的构建 9
2.1 1 LCR家族进化树及蛋白结构分析10
2.1. 2 表达载体构建10
2.2 LCR蛋白组织定位以及亚细胞定位观察10
2.2.1 LCR蛋白组织定位观察11
2.2.2 LCR蛋白亚细胞定位观察12
2.3 突变体鉴定结果分析13
3讨论15
致谢16
参考文献17 缩略词表
LCR peptide: Lowmolecularweight cysteinrich peptide, 低分子质量半胱氨酸富集小肽
CRISPR: Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats, *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
间隔的短回文重复序列
GFP: Green Fluorescent Protein, 绿色荧光蛋白
CRP: cysteinrich peptide, 半胱氨酸富集小肽
io: immature ovule, 未成熟胚囊
mo: mature ovule, 成熟胚囊
sgRNA：short guide RNA, 短链引导RNA
拟南芥精细胞特异表达LCR小肽的功能分析
引言
在被子植物的生活史中，二倍体的孢子体世代和单倍体的配子体世代相互交替，双受精过程在这一世代交替中扮演重要角色。被子植物的雄配子体发生主要过程如下：花粉母细胞通过两次减数分裂形成四分体，后子细胞从四分体中游离出来，成为小孢子，小孢子通过有丝分裂形成生殖细胞和营养细胞，生殖细胞再通过有丝分裂形成两个精细胞。形成被子植物双受精主要划分为以下过程：花粉粒落在柱头，通过黏附、水合、萌发，形成花粉管；萌发的花粉管在乳突细胞间生长，穿过柱头和花柱；花粉管在引导组织中延伸，并穿出隔膜进入子房，沿珠柄生长；花粉管经由珠孔进入胚囊，停止生长，发生爆炸，释放两个精细胞；最后在子房中完成精细胞与卵细胞以及中央细胞的分别融合，从而起始胚胎和胚乳的发育[12]。为准确而有序完成双受精过程，雌雄双方组织间需要大量的物质和信号交流。
一、雄配子体形成
成熟的雄配子体，即花粉粒，是一个通过典型细胞分裂获得的三细胞组织。花粉母细胞在花药内起始减数分裂，形成四分体，每一个四分体由厚厚的胼胝质壁包围，之后由绒毡层提供酶，酶解外壁，释放四个小孢子。在植物的有性生殖过程中，雄配子体在花药腔内发育而来，由绒毡层细胞包被。绒毡层细胞为花粉壁的形成提供前体物质，分泌到腔内，在正在发育中的雄配子体外表沉淀，并且提供营养以供雄配子形成所需。成熟的雄配子体包含精细胞和营养细胞，外围其中，一些金属离子作为重要的营养元素，如镁离子，通过离子转运蛋白，包括镁转运蛋白，运输到腔内。镁转运蛋白（MGTs）定位在质膜上，缺失MGTs的突变体会有明显的育性下降，在高浓度的镁离子条件下育性可以恢复[3]。后期，绒毡层降解，小孢子增大并经历不均等有丝分裂，形成两个“命运迥异”的细胞——较大的细胞称为营养细胞，较小的细胞称为生殖细胞。营养细胞不再分裂，而是发育成为花粉管，生殖细胞包被在营养细胞的细胞质内，并且再次有丝分裂，产生两个精细胞。第二次划分有丝分裂的时间在不同物种中有所差异，有时在花药内发生，而更普遍的情况是在花粉管萌发是发生。通常，在大部分植物中，成熟的花粉先经过脱水，再从花药中释放。在花粉落到柱头上之后，经过水合作用后萌发，营养细胞形成的花粉管不断伸长，将营养核和精细胞输送到雌配子体中，而精细胞进入胚囊则作为花粉发育阶段的终点。对小孢子的不均等有丝分裂过程的突变，已发现两种类型的突变体：sidecar pollen和gemini pollen。前者在花粉外壁中额外产生一个细胞，即有两个大小均等的生殖细胞，二者之一能够正常有丝分裂产生两个精细胞；后者在成熟花粉粒阶段时有两个“营养细胞”，可能由第一次有丝分裂时细胞膜体的错误定位导致，继而产生猜想，不正常分割的胞质因子或许能改变细胞命运。除此以外，还有其他一些在有丝分裂阶段产生畸变的突变体，如duo、impet pollen、ingressus等，以及在精细胞与营养细胞关联性产生突变的突变体，如：mud和gum等[1]。
在植物的生长发育过程中，胞间交流的作用必不可少。胞间交流的主要通道是胞间连丝，在多数植物细胞中连接相邻细胞壁，负责两细胞间的物质运输。成熟的花粉粒中，精细胞外有其自身的质膜，并且包被在营养细胞的内膜内，这两种膜之间的胞外空间有一层薄的多糖物质，而无传统意义的细胞壁，两细胞之间缺乏真正的胞间连丝，却有胞间连丝类似的物质连接精细胞和营养细胞的细胞质。这种连接可能是使精细胞与营养细胞核成为一个“整体”被共同运输到雌配子体中的保证，也可能介导了两种细胞间的胞间交流[4]。已有研究证明，在营养细胞中特异转录的一个基因AHG3，却主要在精细胞中被翻译，并且有证据证明是其转录组转运到精细胞中，但其具体转运机制目前还不得而知。而该项证据则表明精细胞与营养细胞间存在着胞间交流，且营养细胞可能肩负着向精细胞传递转录组的职责[2]。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料与方法6
1.1材料 6
1.2方法 7
1.2.1基于Gateway方法构建载体7
1.2.2CRISPR构建突变体7
1.2.3热激转大肠杆菌8
1.2.4电击转农杆菌8
1.2.5农杆菌转化拟南芥9
1.2.6组织GUS染色观察9
1.2.7花粉粒GFP荧光观察9
1.2.8花粉管体外及半体内萌发9
2结果与分析9
2.1 LCR基因克隆以及载体的构建 9
2.1 1 LCR家族进化树及蛋白结构分析10
2.1. 2 表达载体构建10
2.2 LCR蛋白组织定位以及亚细胞定位观察10
2.2.1 LCR蛋白组织定位观察11
2.2.2 LCR蛋白亚细胞定位观察12
2.3 突变体鉴定结果分析13
3讨论15
致谢16
参考文献17 缩略词表
LCR peptide: Lowmolecularweight cysteinrich peptide, 低分子质量半胱氨酸富集小肽
CRISPR: Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats, *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
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GFP: Green Fluorescent Protein, 绿色荧光蛋白
CRP: cysteinrich peptide, 半胱氨酸富集小肽
io: immature ovule, 未成熟胚囊
mo: mature ovule, 成熟胚囊
sgRNA：short guide RNA, 短链引导RNA
拟南芥精细胞特异表达LCR小肽的功能分析
引言
在被子植物的生活史中，二倍体的孢子体世代和单倍体的配子体世代相互交替，双受精过程在这一世代交替中扮演重要角色。被子植物的雄配子体发生主要过程如下：花粉母细胞通过两次减数分裂形成四分体，后子细胞从四分体中游离出来，成为小孢子，小孢子通过有丝分裂形成生殖细胞和营养细胞，生殖细胞再通过有丝分裂形成两个精细胞。形成被子植物双受精主要划分为以下过程：花粉粒落在柱头，通过黏附、水合、萌发，形成花粉管；萌发的花粉管在乳突细胞间生长，穿过柱头和花柱；花粉管在引导组织中延伸，并穿出隔膜进入子房，沿珠柄生长；花粉管经由珠孔进入胚囊，停止生长，发生爆炸，释放两个精细胞；最后在子房中完成精细胞与卵细胞以及中央细胞的分别融合，从而起始胚胎和胚乳的发育[12]。为准确而有序完成双受精过程，雌雄双方组织间需要大量的物质和信号交流。
一、雄配子体形成
成熟的雄配子体，即花粉粒，是一个通过典型细胞分裂获得的三细胞组织。花粉母细胞在花药内起始减数分裂，形成四分体，每一个四分体由厚厚的胼胝质壁包围，之后由绒毡层提供酶，酶解外壁，释放四个小孢子。在植物的有性生殖过程中，雄配子体在花药腔内发育而来，由绒毡层细胞包被。绒毡层细胞为花粉壁的形成提供前体物质，分泌到腔内，在正在发育中的雄配子体外表沉淀，并且提供营养以供雄配子形成所需。成熟的雄配子体包含精细胞和营养细胞，外围其中，一些金属离子作为重要的营养元素，如镁离子，通过离子转运蛋白，包括镁转运蛋白，运输到腔内。镁转运蛋白（MGTs）定位在质膜上，缺失MGTs的突变体会有明显的育性下降，在高浓度的镁离子条件下育性可以恢复[3]。后期，绒毡层降解，小孢子增大并经历不均等有丝分裂，形成两个“命运迥异”的细胞——较大的细胞称为营养细胞，较小的细胞称为生殖细胞。营养细胞不再分裂，而是发育成为花粉管，生殖细胞包被在营养细胞的细胞质内，并且再次有丝分裂，产生两个精细胞。第二次划分有丝分裂的时间在不同物种中有所差异，有时在花药内发生，而更普遍的情况是在花粉管萌发是发生。通常，在大部分植物中，成熟的花粉先经过脱水，再从花药中释放。在花粉落到柱头上之后，经过水合作用后萌发，营养细胞形成的花粉管不断伸长，将营养核和精细胞输送到雌配子体中，而精细胞进入胚囊则作为花粉发育阶段的终点。对小孢子的不均等有丝分裂过程的突变，已发现两种类型的突变体：sidecar pollen和gemini pollen。前者在花粉外壁中额外产生一个细胞，即有两个大小均等的生殖细胞，二者之一能够正常有丝分裂产生两个精细胞；后者在成熟花粉粒阶段时有两个“营养细胞”，可能由第一次有丝分裂时细胞膜体的错误定位导致，继而产生猜想，不正常分割的胞质因子或许能改变细胞命运。除此以外，还有其他一些在有丝分裂阶段产生畸变的突变体，如duo、impet pollen、ingressus等，以及在精细胞与营养细胞关联性产生突变的突变体，如：mud和gum等[1]。
在植物的生长发育过程中，胞间交流的作用必不可少。胞间交流的主要通道是胞间连丝，在多数植物细胞中连接相邻细胞壁，负责两细胞间的物质运输。成熟的花粉粒中，精细胞外有其自身的质膜，并且包被在营养细胞的内膜内，这两种膜之间的胞外空间有一层薄的多糖物质，而无传统意义的细胞壁，两细胞之间缺乏真正的胞间连丝，却有胞间连丝类似的物质连接精细胞和营养细胞的细胞质。这种连接可能是使精细胞与营养细胞核成为一个“整体”被共同运输到雌配子体中的保证，也可能介导了两种细胞间的胞间交流[4]。已有研究证明，在营养细胞中特异转录的一个基因AHG3，却主要在精细胞中被翻译，并且有证据证明是其转录组转运到精细胞中，但其具体转运机制目前还不得而知。而该项证据则表明精细胞与营养细胞间存在着胞间交流，且营养细胞可能肩负着向精细胞传递转录组的职责[2]。
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