crisprcas9技术的稻曲病遗传转化体系的建立及基因敲除载体的构建
水稻稻曲病是由病原真菌Ustilaginoidea virens 引起的一种水稻穗部病害。该病害在世界范围均有流行，并已经逐渐上升为我国水稻的主要病害，不仅导致了水稻产量的严重损失，并且稻曲病菌会合成产生对人畜家禽和植物均有害的稻曲菌素，严重危及粮食安全。目前针对稻曲病菌功能基因的研究主要通过病原菌表达谱分析，或者通过随机插入突变体库获得突变体来对其基因功能进行分析，然而通过同源重组获得的基因敲除突变体的遗传转化体系尚不稳定和成熟。由于基因敲除突变体的获得是研究功能基因的基础，遗传转化体系的不成熟严重限制了稻曲病菌基因功能的研究。本实验基于CRISPR/Cas9技术，构建了稳定成熟的稻曲病菌遗传转化体系，并功获得了功能基因的敲除突变体，而后初步观察了敲除突变体的生物学表型。研究结果将为快速解析稻曲病菌的基因功能及致病分子机理提供实验基础和技术支撑。
目录
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摘要2
关键词2
Abstract2
Key words 2
引言3
1 材料与方法4
1.1 材料4
1.1.1供试的菌株和培养基 4
1.2方法 4
1.2.1引物设计原则 4
1.2.2 CRISPR载体的构建方法4
1.2.3 敲除载体的构建 5
1.2.4酵母菌落质粒的大肠杆菌转化 5
1.2.5目的基因片段和载体的酵母转化 5
1.2.6酵母感受态细胞的制备 5
1.2.7 酵母转化 5
1.2.8稻曲病菌的原生质体转化6
2 结果与分析 6
2.1PDEH基因敲除的构建 6
2.2 转化子的筛选验证 7
2.3突变体的表型分析8
2.3.1 PDEH基因敲除突变体菌丝发生自溶现象 8
2.3.2 PDEH基因敲除突变体孢子形态异常 8
3 讨论9
致谢 9
参考文献 10
基于CRISPR/Cas9技术的稻曲病菌遗传转化体系的建立及基因敲除载体构建
引言
Abs *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
tract: Rice false smut is a rice panicle disease caused by Ustilaginoidea virens. The disease in the world were popular, and has gradually become the main rice diseases in China, not only seriously caused the loss of rice yield, and produced false smut bacteria are harmful to human and livestock and poultry plants, endanger food security. The current study of rice gene functional bacteria mainly through pathogen expression analysis or by random insertional mutant library of mutants obtained to analyze gene function, however, obtained by homologous recombination knockout mutants in genetic transformation system is not stable and mature. Because the gene knockout mutant is the basis of studying functional genes, the immaturity of genetic transformation system severely limits the gene function of rice germ smut. In this experiment, a stable and mature genetic transformation system of rice blast fungus was constructed based on CRISPR/Cas9 technology. The knockout mutants of functional genes were obtained, and the biological phenotype of knock out mutant was preliminarily observed. The results will provide experimental basis and technical support for rapid analysis of gene function and pathogenic molecular mechanism of rice blast fungus.
引言 由稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）引起的水稻稻曲病在全世界范围内的流行趋于严重，并且在我国水稻生产过程中已经逐渐由次要病害上升为主要病害。稻曲病菌的致病过程是稻曲病菌与水稻相互识别、相互作用的过程。目前针对稻曲病菌所进行的基因功能研究，以及稻曲病菌在侵染过程中与寄主植物的分子互作机制，主要通过病原菌的基因表达谱分析，或是通过随机插入突变体库进行性状筛选的方法进行。通过基因敲除获得靶标基因的敲除突变体，是基因功能验证的基础。但是由于该病原菌同源重组的效率极低，目前该病原菌的基因敲除体系尚未成熟[1]，很难对稻曲病菌的靶标基因进行深入研究，极大限制了对于该病原菌基因功能的研究，也限制了对该病原菌分子致病机理的研究。稻曲病菌中Pdeh基因及其同源基因在近缘菌中的序列和功能较为保守，且对于病原真菌完成其生活史较为重要，Pdeh基因的缺失会出现一系列的突变表型。因此，本实验在构建稻曲病菌基因敲除体系的过程中，选定了稻曲病菌中的Pdeh基因做为靶标基因进行敲除。
CRISPR /Cas9 系统是一种细菌或者古细菌中的后天免疫防御系统，其功能是保护古细菌和细菌免受外来噬菌体或质粒的侵入。这类细菌或古细菌基因组的CRISPR序列能够表达与入侵者基因组序列相识别的RNA。当噬菌体或质粒等外源DNA入侵菌体时，该防御系统的CRISPR序列会相应的表达这类RNA 并通过互补序列结合和识别入侵者的基因组序列，然后CRISPR 序列的相关酶(Cas)在序列识别处切割入侵的外源基因组DNA，从而达到抵制入侵的目的。近几年来兴起的基因组定点编辑技术主要包括以下几种DNA核酸酶：锌指核酸酶(ZFNs)，归巢核酸内切酶，类转录激活因子效应物核酸酶(TALENs)等[2]，它们均依赖于在特异位点产生的DNA双链断裂，激活细胞内DNA修复机制，如同源重组和非同源末端的连接，导致特异位点的编辑。然而，TALANs和ZFNs操作技术复杂，且对DNA甲基化较为敏感，因而限制了其大范围的应用。CRISPR/Cas系统(CRISPR/Cas system)是于2013年新发现的基因组编辑技术，不但能克服以上缺点[3]，而且可以同时编辑多个基因，大大提高了基因编辑的效率，因此具有更大的应用潜力。目前，CRISPR/Cas9系统已经作为一种高效的基因定点编辑技术而广泛应用于植物研究中[4]。
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摘要2
关键词2
Abstract2
Key words 2
引言3
1 材料与方法4
1.1 材料4
1.1.1供试的菌株和培养基 4
1.2方法 4
1.2.1引物设计原则 4
1.2.2 CRISPR载体的构建方法4
1.2.3 敲除载体的构建 5
1.2.4酵母菌落质粒的大肠杆菌转化 5
1.2.5目的基因片段和载体的酵母转化 5
1.2.6酵母感受态细胞的制备 5
1.2.7 酵母转化 5
1.2.8稻曲病菌的原生质体转化6
2 结果与分析 6
2.1PDEH基因敲除的构建 6
2.2 转化子的筛选验证 7
2.3突变体的表型分析8
2.3.1 PDEH基因敲除突变体菌丝发生自溶现象 8
2.3.2 PDEH基因敲除突变体孢子形态异常 8
3 讨论9
致谢 9
参考文献 10
基于CRISPR/Cas9技术的稻曲病菌遗传转化体系的建立及基因敲除载体构建
引言
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tract: Rice false smut is a rice panicle disease caused by Ustilaginoidea virens. The disease in the world were popular, and has gradually become the main rice diseases in China, not only seriously caused the loss of rice yield, and produced false smut bacteria are harmful to human and livestock and poultry plants, endanger food security. The current study of rice gene functional bacteria mainly through pathogen expression analysis or by random insertional mutant library of mutants obtained to analyze gene function, however, obtained by homologous recombination knockout mutants in genetic transformation system is not stable and mature. Because the gene knockout mutant is the basis of studying functional genes, the immaturity of genetic transformation system severely limits the gene function of rice germ smut. In this experiment, a stable and mature genetic transformation system of rice blast fungus was constructed based on CRISPR/Cas9 technology. The knockout mutants of functional genes were obtained, and the biological phenotype of knock out mutant was preliminarily observed. The results will provide experimental basis and technical support for rapid analysis of gene function and pathogenic molecular mechanism of rice blast fungus.
引言 由稻曲病菌（Ustilaginoidea virens）引起的水稻稻曲病在全世界范围内的流行趋于严重，并且在我国水稻生产过程中已经逐渐由次要病害上升为主要病害。稻曲病菌的致病过程是稻曲病菌与水稻相互识别、相互作用的过程。目前针对稻曲病菌所进行的基因功能研究，以及稻曲病菌在侵染过程中与寄主植物的分子互作机制，主要通过病原菌的基因表达谱分析，或是通过随机插入突变体库进行性状筛选的方法进行。通过基因敲除获得靶标基因的敲除突变体，是基因功能验证的基础。但是由于该病原菌同源重组的效率极低，目前该病原菌的基因敲除体系尚未成熟[1]，很难对稻曲病菌的靶标基因进行深入研究，极大限制了对于该病原菌基因功能的研究，也限制了对该病原菌分子致病机理的研究。稻曲病菌中Pdeh基因及其同源基因在近缘菌中的序列和功能较为保守，且对于病原真菌完成其生活史较为重要，Pdeh基因的缺失会出现一系列的突变表型。因此，本实验在构建稻曲病菌基因敲除体系的过程中，选定了稻曲病菌中的Pdeh基因做为靶标基因进行敲除。
CRISPR /Cas9 系统是一种细菌或者古细菌中的后天免疫防御系统，其功能是保护古细菌和细菌免受外来噬菌体或质粒的侵入。这类细菌或古细菌基因组的CRISPR序列能够表达与入侵者基因组序列相识别的RNA。当噬菌体或质粒等外源DNA入侵菌体时，该防御系统的CRISPR序列会相应的表达这类RNA 并通过互补序列结合和识别入侵者的基因组序列，然后CRISPR 序列的相关酶(Cas)在序列识别处切割入侵的外源基因组DNA，从而达到抵制入侵的目的。近几年来兴起的基因组定点编辑技术主要包括以下几种DNA核酸酶：锌指核酸酶(ZFNs)，归巢核酸内切酶，类转录激活因子效应物核酸酶(TALENs)等[2]，它们均依赖于在特异位点产生的DNA双链断裂，激活细胞内DNA修复机制，如同源重组和非同源末端的连接，导致特异位点的编辑。然而，TALANs和ZFNs操作技术复杂，且对DNA甲基化较为敏感，因而限制了其大范围的应用。CRISPR/Cas系统(CRISPR/Cas system)是于2013年新发现的基因组编辑技术，不但能克服以上缺点[3]，而且可以同时编辑多个基因，大大提高了基因编辑的效率，因此具有更大的应用潜力。目前，CRISPR/Cas9系统已经作为一种高效的基因定点编辑技术而广泛应用于植物研究中[4]。
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