手性农药甲基异柳磷对映体的细胞毒性
本论文以手性有机磷杀虫剂甲基异柳磷为研究对象，首先用HPLC串联Lux Cellulose-3手性柱对甲基异柳磷进行对映体分离，利用实验测定电子圆二色谱与计算圆二色谱图进行比对，确定了两对映体的绝对构型，其中Peak1为S体，Peak2为R体。在此基础上研究了甲基异柳磷外消旋体及其对映异构体对Hep G2细胞的细胞毒性，研究表明，在高浓度处理组，两对映体均表现出较高的毒性，对映体间无显著性差异，低浓度时R-甲基异柳磷的毒性显著大于S-甲基异柳磷（药剂浓度39.5mg/L时，R体的毒性是S的3.2倍）。研究甲基异柳磷对超氧化物歧化酶（SOD），过氧化氢酶（CAT），乳酸脱氢酶（LDH）活性，以及丙二醛（MDA）含量等氧化应激方面的影响发现，SOD和CAT 的活力随着药剂浓度的增加逐渐降低；胞外LDH的活力和胞内MDA的含量随着药剂浓度逐渐增加。进一步探究了甲基异柳磷对Hep G2产生立体选择性毒性的机理，为相应的风险评估提供科学全面的理论依据。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1实验材料 3
1.1细胞株 3
1.2实验药剂 3
1.3主要仪器和试剂 3
2实验方法 3
2.1甲基异柳磷手性拆分仪器条件的确定 3
2.2相关用液的配制 5
2.3 细胞的培养及处理 5
2.4细胞活性测定（CCK8法） 5
2.5乳酸脱氢酶（LDH）的释放量的测定 5
2.6 细胞氧化应激反应 6
3结果分析 8
3.1 甲基异柳磷对Hep G2细胞毒性对映体选择性影响8
3.2 甲基异柳磷对Hep G2细胞LDH释放量的对映体选择性影响 9
3.3 甲基异柳磷对Hep G2细胞产生氧化应激的对映体选择性9
4讨论 11
致谢 12
参考文献 13
手性农药甲基异柳磷对映体的细胞毒性
引言
引言
据报道，全世界范围内每年因农药中毒死 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
亡的人数多达30万人[1]，化学农药的大量使用是造成土壤、 地表水污染乃至食品安全问题的主要因素之一[2]。当前世界范围内生产和使用的农药品种中有30% 具有手性，在手性农药中仅有20%的农药为富含高效对映体，并且这一比例会随着农药研发技术的提高及新化合物结构不断出现而呈递增趋势。手性对映体具有相同的理化性质，然而当这些手性化合物进入到手性环境中时，往往会在生理，生化等方面表现出显著地立体选择性[3,4]。大量实验研究数据表明，手性农药在进入自然界后，其在环境媒介中的降解代谢过程往往都是具有立体选择性的[5]。研究手性农药在对映体水平的毒性、活性以及在环境中的降解代谢对手性农药的安全评估具有重大的意义。但通过传统的非手性分析检测手段对手性农药评估得出的毒理学数据与实际生态毒理学效应有较大差异，导致手性农药的风险评估不准确，给人类健康和环境安全带来了潜在威胁。因此开展手性农药对映体水平的安全评价是对传统农药残留研究的补充，是深层次的农药安全评价研究[6]。
有机磷被广泛用作杀虫、杀菌、除草及植物生长调节剂，这些手性化合物的手性既可源于不对称碳原子，也可源于磷原子，因此手性品种非常多（大约60余种）。它们绝大多数为四价五配位的磷化合物，通常具有P=S或P=O以及其他三个与磷原子相连的取代基，构成一个四面体构型。当A，B，C为三个各不相同的取代基时，磷原子就成为一个手性中心，形成了一对对映异构体。有机磷手性农药对映体之间存在着不同的生物活性，包括毒性、酶抑制活性和生物降解能力等[7]。迄今，人们已对有机磷对映异构体的制备、分离、各种生物活性进行了大量的研究[8]。研究表明有机磷不同对映体间的相对药效、毒性、酶抑制活性和生物降解等方面的差异有时很大（如苯腈磷、异柳磷），有时较小（蔬果磷）[9]。
甲基异柳磷，O甲基O(二异丙氧基羰基苯基)N异丙基硫代磷酸酯（图1），含一个手性磷原子，两个对映体，具有较强的触杀性和胃毒性，杀虫谱广，残效期长，主要用于防治地下害虫，对蚜虫、红蜘蛛、梨小食心虫等具有较好的活性。目前，关于该药物的手性拆分方面的研究还鲜有报道，在相关农产品及土壤中的降解，乃至甲基异柳磷在对映体水平上对靶标生物的活性，对非靶标生物的急性毒性及对靶标酶的抑制活性方面尚未见报道。前期研究表明，细胞受损伤的程度与胞外的乳酸脱氢酶（LDH）的释放量有较好的正相关性[10]。氧化应激可以简单的认为是氧自由基的过量生成导致的细胞磷脂层发生的过氧化反应和机体防御体系的能力失衡[11]。如果机体长期处于氧自由基过量或抗氧化能力不足这一状态，很可能会对机体产生慢性的、不可逆的伤害。药物在不同组织中暴露导致的氧化应激现象已被认为是导致生态毒性和细胞毒性产生的主要原因[12,13]。
图1 甲基异柳磷两个对映体的结构图（*为手性中心）
本课题以此为切入点，首先建立起能够有效拆分甲基异柳磷两对映体的仪器拆分条件，在此基础上，选用Hep G2细胞为体外实验模型，研究了甲基异柳磷外消旋体及其对映体对Hep G2的细胞毒性。 此外，本论文进一步研究了甲基异柳磷两对映体作用后导致Hep G2 产生氧化应激反应（相关指标：超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA））的对映体选择性差异，探讨甲基异柳磷对Hep G2细胞产生对映体选择性细胞毒性和氧化应激之间的关系。本课题研究手性农药甲基异柳磷对映体的细胞毒性，对手性农药的使用和安全性评价具有重要意义。
1实验材料
1．1细胞系
选用肝癌Hep G2细胞系为体外实验模型。
1.2实验药剂
Rac甲基异柳磷分析标准品（98.1%），甲基异柳磷对映体（99.9%，上海勤路生物技术有限公司）。
1.3主要仪器和试剂
高效液相色谱Aglient1200（Agilent, USA）；Lux Cellulose3(250 mm × 4.6 mm i.d., 5 μm) (Phenomenex,China)；超纯水系统MUL9000（南京总馨纯水设备有限公司，中国）；Jasco J815圆二色谱仪（东京，日本）；酶标仪；各种规格的单通道移液枪（eppendorf，德国）；超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；细胞培养板（24孔、96孔，COSTAR, USA）；二氧化碳培养箱（赛默飞世尔，美国）；Avanti J26S XP 高速离心机(Beckman Coulter, USA)；恒温水浴箱；4℃、20℃和80℃冰箱（海尔，中国）；液氮储存罐(ARPEGE40LIQUIDE,上海沪峰化工有限公司)；细菌过滤器（费森尤斯，德国）；细胞培养瓶（COSTAR, USA）；酒精灯。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1实验材料 3
1.1细胞株 3
1.2实验药剂 3
1.3主要仪器和试剂 3
2实验方法 3
2.1甲基异柳磷手性拆分仪器条件的确定 3
2.2相关用液的配制 5
2.3 细胞的培养及处理 5
2.4细胞活性测定（CCK8法） 5
2.5乳酸脱氢酶（LDH）的释放量的测定 5
2.6 细胞氧化应激反应 6
3结果分析 8
3.1 甲基异柳磷对Hep G2细胞毒性对映体选择性影响8
3.2 甲基异柳磷对Hep G2细胞LDH释放量的对映体选择性影响 9
3.3 甲基异柳磷对Hep G2细胞产生氧化应激的对映体选择性9
4讨论 11
致谢 12
参考文献 13
手性农药甲基异柳磷对映体的细胞毒性
引言
引言
据报道，全世界范围内每年因农药中毒死 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
亡的人数多达30万人[1]，化学农药的大量使用是造成土壤、 地表水污染乃至食品安全问题的主要因素之一[2]。当前世界范围内生产和使用的农药品种中有30% 具有手性，在手性农药中仅有20%的农药为富含高效对映体，并且这一比例会随着农药研发技术的提高及新化合物结构不断出现而呈递增趋势。手性对映体具有相同的理化性质，然而当这些手性化合物进入到手性环境中时，往往会在生理，生化等方面表现出显著地立体选择性[3,4]。大量实验研究数据表明，手性农药在进入自然界后，其在环境媒介中的降解代谢过程往往都是具有立体选择性的[5]。研究手性农药在对映体水平的毒性、活性以及在环境中的降解代谢对手性农药的安全评估具有重大的意义。但通过传统的非手性分析检测手段对手性农药评估得出的毒理学数据与实际生态毒理学效应有较大差异，导致手性农药的风险评估不准确，给人类健康和环境安全带来了潜在威胁。因此开展手性农药对映体水平的安全评价是对传统农药残留研究的补充，是深层次的农药安全评价研究[6]。
有机磷被广泛用作杀虫、杀菌、除草及植物生长调节剂，这些手性化合物的手性既可源于不对称碳原子，也可源于磷原子，因此手性品种非常多（大约60余种）。它们绝大多数为四价五配位的磷化合物，通常具有P=S或P=O以及其他三个与磷原子相连的取代基，构成一个四面体构型。当A，B，C为三个各不相同的取代基时，磷原子就成为一个手性中心，形成了一对对映异构体。有机磷手性农药对映体之间存在着不同的生物活性，包括毒性、酶抑制活性和生物降解能力等[7]。迄今，人们已对有机磷对映异构体的制备、分离、各种生物活性进行了大量的研究[8]。研究表明有机磷不同对映体间的相对药效、毒性、酶抑制活性和生物降解等方面的差异有时很大（如苯腈磷、异柳磷），有时较小（蔬果磷）[9]。
甲基异柳磷，O甲基O(二异丙氧基羰基苯基)N异丙基硫代磷酸酯（图1），含一个手性磷原子，两个对映体，具有较强的触杀性和胃毒性，杀虫谱广，残效期长，主要用于防治地下害虫，对蚜虫、红蜘蛛、梨小食心虫等具有较好的活性。目前，关于该药物的手性拆分方面的研究还鲜有报道，在相关农产品及土壤中的降解，乃至甲基异柳磷在对映体水平上对靶标生物的活性，对非靶标生物的急性毒性及对靶标酶的抑制活性方面尚未见报道。前期研究表明，细胞受损伤的程度与胞外的乳酸脱氢酶（LDH）的释放量有较好的正相关性[10]。氧化应激可以简单的认为是氧自由基的过量生成导致的细胞磷脂层发生的过氧化反应和机体防御体系的能力失衡[11]。如果机体长期处于氧自由基过量或抗氧化能力不足这一状态，很可能会对机体产生慢性的、不可逆的伤害。药物在不同组织中暴露导致的氧化应激现象已被认为是导致生态毒性和细胞毒性产生的主要原因[12,13]。
图1 甲基异柳磷两个对映体的结构图（*为手性中心）
本课题以此为切入点，首先建立起能够有效拆分甲基异柳磷两对映体的仪器拆分条件，在此基础上，选用Hep G2细胞为体外实验模型，研究了甲基异柳磷外消旋体及其对映体对Hep G2的细胞毒性。 此外，本论文进一步研究了甲基异柳磷两对映体作用后导致Hep G2 产生氧化应激反应（相关指标：超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA））的对映体选择性差异，探讨甲基异柳磷对Hep G2细胞产生对映体选择性细胞毒性和氧化应激之间的关系。本课题研究手性农药甲基异柳磷对映体的细胞毒性，对手性农药的使用和安全性评价具有重要意义。
1实验材料
1．1细胞系
选用肝癌Hep G2细胞系为体外实验模型。
1.2实验药剂
Rac甲基异柳磷分析标准品（98.1%），甲基异柳磷对映体（99.9%，上海勤路生物技术有限公司）。
1.3主要仪器和试剂
高效液相色谱Aglient1200（Agilent, USA）；Lux Cellulose3(250 mm × 4.6 mm i.d., 5 μm) (Phenomenex,China)；超纯水系统MUL9000（南京总馨纯水设备有限公司，中国）；Jasco J815圆二色谱仪（东京，日本）；酶标仪；各种规格的单通道移液枪（eppendorf，德国）；超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；细胞培养板（24孔、96孔，COSTAR, USA）；二氧化碳培养箱（赛默飞世尔，美国）；Avanti J26S XP 高速离心机(Beckman Coulter, USA)；恒温水浴箱；4℃、20℃和80℃冰箱（海尔，中国）；液氮储存罐(ARPEGE40LIQUIDE,上海沪峰化工有限公司)；细菌过滤器（费森尤斯，德国）；细胞培养瓶（COSTAR, USA）；酒精灯。
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