naa对水稻多分蘖突变体的调控
突变体D12W191由武育粳3号诱变而来，与野生型武育粳3号相比，其分蘖数明显增多。萘乙酸NAA是一种分蘖抑制剂它可以很好地调控普通的常规水稻品种分蘖的发生，但是突变体D12W191对NAA是否响应还没有研究过。本试验以野生型武育粳3号及其多分蘖突变体D12W191为材料，以着生在分蘖节上的分蘖芽和分蘖节为研究对象，在供试材料主茎10露尖时进行叶面喷施NAA进行处理，主要观察主茎第8叶腋分蘖芽的生长状况，同时测定分蘖节和分蘖芽的内源生长素和细胞分裂素的含量，进一步研究控制水稻分蘖发生相关基因的变化情况。研究结果表明，外源NAA处理可以明显抑制多分蘖突变体D12W191分蘖芽的生长，使分蘖芽进入生长停滞状态，同时也降低了分蘖节和分蘖芽中的内源IAA和Z+ZR的含量。荧光定量PCR数据也表明，NAA通过抑制细胞分裂素的合成和促进细胞分裂素的降解从而降低其含量，独脚金内酯的合成及信号转导同样也受到NAA的抑制。TCP家族转录因子OsTB1作用于细胞分裂素和独脚金内酯的下游，是水稻分蘖发生的负调控因子，它的表达受到外源NAA的诱导。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words: 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1供试材料 2
1.2试验处理 3
1.3测定项目 3
1.4测定方法 3
1.4.1 RNA的提取 3
1.4.2 反转录PCR 4
1.4.3 荧光定量PCR 4
1.5数据分析 5
2 结果与分析 5
2.1外源NAA对分蘖芽生长的影响 5
2.2外源NAA处理对分蘖芽和分蘖节中内源生长素及细胞分裂素含量的影响 5
2.3外源NAA处理对细胞分裂素合成相关基因的调控效应 6
2.4外源NAA处理对细胞分裂素降解相关基因的调控效应 7
2.5外源NAA处理对独脚金内酯合成及信号转导相关基因的调控效应 9
2.6外源NAA处理对OsTB1基因的调控效应 10
3 讨论与结论 10
致谢： 11
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
参考文献 12
NAA对水稻多分蘖突变体的调控
引言
引言：水稻分蘖形成过程可分为两个步骤，分蘖芽的形成和分蘖芽萌发生长[1]。已有的研究表明，从分蘖原基的出现到分蘖芽的形成较少受外界因素影响，而分蘖芽后续的萌发生长并最终发育为分蘖受制于多种内外因素[2]，其中，植物激素在腋芽的休眠萌发转换过程中发挥着极其重要的作用。生长素是最早与植物分枝联系起来的激素，对腋芽生长具有抑制作用，而且这种抑制作用不是直接的，而是通过别的途径来间接影响的。到目前为止，学术界存在两套独立的理论来解释生长素的间接抑制作用调控腋芽生长的作用机理。第一种为第二信使假说，该假说认为生长素对腋芽的抑制作用是依靠一类能够向上移动的信号物质来实现的，这类信号物质作为生长素的第二信使直接进入腋芽中调控其生长[35]。另外一种假说为生长素运输渠道形成假说，该假说认为腋芽中自身合成的生长素向外运输是腋芽活化的前提，而由顶端和已经活化的腋芽源源不断的向主茎运输生长素，使生长素库强增大，抑制休眠芽内的生长素向主茎中运输，从而抑制侧芽的生长[6, 7]。这两个理论还未经完全证实，有些现象还无法单独用其中某一个理论来解释。萘乙酸NAA是一种外源合成的生长素类似物,与外源合成的吲哚乙酸IAA相比具有稳定性好、价格低廉等特点，因此被广泛用于植物生长的调节过程。刘杨等[8]研究表明NAA几乎能够完全抑制水稻分蘖芽的生长。本文运用一个新型的多分蘖突变体，采用叶面喷施萘乙酸NAA的技术手段，初步探索多分蘖突变体是否同常规水稻品种一样对外源NAA有响应，并研究了NAA处理后分蘖芽和分蘖节内源激素含量以及相关基因表达的变化。
1 材料与方法
1.1供试材料
本试验的供试材料为粳稻品种武育粳3号及以武育粳3号为亲本利用EMS诱导突变获得的矮秆多分蘖突变体（编号为D12W191），突变体材料经过4个世代的选育，株系内性状已经稳定。突变体D12W191相对于野生型武育粳3号表现出多蘖、矮秆等特性（图1）。在苗期两者的地上部表型没有显著差异，移栽后45天，两者的分蘖数和株高表现出显著的差异，武育粳3号的平均分蘖数达到24.4±2.1个,株高约为60±3.6cm，而突变体分蘖数多于42.5±4.4个,株高约为43±2.6cm。
图1.武育粳3号与D12W191的株高和分蘖
Fig1. Plant height and tiller numbers of Wuyujing 3 and D12W191
注：WT、mut分别代表野生型武育粳3号和突变体D12W191,下同。
Note：WT and mut represent Wuyujing 3 and D12W191 respectively.
1.2试验处理
本试验于2015年在大学丹阳试验基地玻璃温室进行。8月25播种，9月20选取生长一致的秧苗移栽至装有15kg过筛土的盆钵中，单苗移栽，每盆10苗。在主茎10叶露尖时进行如下处理：（1）、NAA处理，叶面喷施100mg/L的NAA（NAA用少量的无水乙醇溶解后再用清水稀释）；（2）对照（CK），喷施含有与NAA处理相同浓度无水乙醇的清水。
1.3测定项目
a.分蘖芽长度：从处理当天至处理后第4天每天取样一次，取主茎第8叶腋内的分蘖芽，每处理共取20个芽，测量其长度。
b.内源生长素和细胞分裂素含量：在处理0h、6h、12h、24h、36h后，取主茎第8叶腋处的分蘖节及其着生的分蘖芽，液氮速冻后超低温（70℃）保存留待进行激素含量测定。内源生长素、玉米素+玉米素核苷的提取与纯化参考杨建昌等[9]的方法，略有改动。称取0.20.5g新鲜植物材料，加2ml样品提取液（内含1mmol L1BHT的80%甲醇），在冰浴下研磨成匀浆，转入10ml试管，再用2ml提取液分次将研钵冲洗干净，一并转入试管中，摇匀后放置在4℃冰箱中。4℃下提取4h，3500转/min离心8min, 取上清液。沉淀中加1ml提取液，搅匀，置4℃下再提取1h，离心，合并上清液，残渣弃去。上清液过C18固相萃取柱，具体步骤是：80%甲醇（1ml）平衡柱→上样→收集样品→移开样品后用100%甲醇（5ml）洗柱→100%乙醚（5ml）洗柱→100%甲醇（5ml）洗柱→循环。将过柱后的样品转入10ml塑料离心管中，真空浓缩干燥或用氮气吹干，除去提取液中的甲醇，用样品稀释液（100ml pH7.5磷酸缓冲液中加入0.1mlTween20）定容（一般1g鲜重用2ml左右样品稀释液定容）。内源激素含量采用酶联免疫法进行测定，酶联免疫试剂盒购自中国农业大学，具体操作步骤参照试剂盒说明书，使用Spectramax plus型酶标仪测定各浓度标准物及各样品在490nm处的OD值。
c.基因表达分析：在处理0h和6h时，取主茎第8叶腋处的分蘖节及其着生的分蘖芽，液氮速冻后超低温（70℃）保存留待进行基因表达分析，具体方法与基因引物序列如下:
使用E.Z.N.A.? Plant RNA Kit (Omega Biotek, Inc, USA)提取各部位RNA，并除去基因组DNA。提取组织RNA后，用紫外分光光度计测定OD260和OD280，检测RNA质量并计算RNA浓度，检测合格后，按PrimScriptTM RT reagent Kit (Takara, Kyoto, Japan)说明书进行反转录。先按照说明书中所列出的组分配制RT反应液，然后进行反转录，反转录仪器采用美国BioRad公司的PTC0200 DNA Engine Cycler。反转录结束后，使用SYBR Premix Ex TaqTM (Takara, Kyoto, Japan)试剂盒和ABI 7300荧光定量PCR仪进行realtime RTPCR反应，按试剂盒说明书进行操作，先配制RT反应液，再进行Real Time PCR反应，以ACTIN基因作为内标基因，各基因PCR引物序列见下表，所有样品设3次重复,结果采用Deltadelta Ct 法分析。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words: 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1供试材料 2
1.2试验处理 3
1.3测定项目 3
1.4测定方法 3
1.4.1 RNA的提取 3
1.4.2 反转录PCR 4
1.4.3 荧光定量PCR 4
1.5数据分析 5
2 结果与分析 5
2.1外源NAA对分蘖芽生长的影响 5
2.2外源NAA处理对分蘖芽和分蘖节中内源生长素及细胞分裂素含量的影响 5
2.3外源NAA处理对细胞分裂素合成相关基因的调控效应 6
2.4外源NAA处理对细胞分裂素降解相关基因的调控效应 7
2.5外源NAA处理对独脚金内酯合成及信号转导相关基因的调控效应 9
2.6外源NAA处理对OsTB1基因的调控效应 10
3 讨论与结论 10
致谢： 11
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
参考文献 12
NAA对水稻多分蘖突变体的调控
引言
引言：水稻分蘖形成过程可分为两个步骤，分蘖芽的形成和分蘖芽萌发生长[1]。已有的研究表明，从分蘖原基的出现到分蘖芽的形成较少受外界因素影响，而分蘖芽后续的萌发生长并最终发育为分蘖受制于多种内外因素[2]，其中，植物激素在腋芽的休眠萌发转换过程中发挥着极其重要的作用。生长素是最早与植物分枝联系起来的激素，对腋芽生长具有抑制作用，而且这种抑制作用不是直接的，而是通过别的途径来间接影响的。到目前为止，学术界存在两套独立的理论来解释生长素的间接抑制作用调控腋芽生长的作用机理。第一种为第二信使假说，该假说认为生长素对腋芽的抑制作用是依靠一类能够向上移动的信号物质来实现的，这类信号物质作为生长素的第二信使直接进入腋芽中调控其生长[35]。另外一种假说为生长素运输渠道形成假说，该假说认为腋芽中自身合成的生长素向外运输是腋芽活化的前提，而由顶端和已经活化的腋芽源源不断的向主茎运输生长素，使生长素库强增大，抑制休眠芽内的生长素向主茎中运输，从而抑制侧芽的生长[6, 7]。这两个理论还未经完全证实，有些现象还无法单独用其中某一个理论来解释。萘乙酸NAA是一种外源合成的生长素类似物,与外源合成的吲哚乙酸IAA相比具有稳定性好、价格低廉等特点，因此被广泛用于植物生长的调节过程。刘杨等[8]研究表明NAA几乎能够完全抑制水稻分蘖芽的生长。本文运用一个新型的多分蘖突变体，采用叶面喷施萘乙酸NAA的技术手段，初步探索多分蘖突变体是否同常规水稻品种一样对外源NAA有响应，并研究了NAA处理后分蘖芽和分蘖节内源激素含量以及相关基因表达的变化。
1 材料与方法
1.1供试材料
本试验的供试材料为粳稻品种武育粳3号及以武育粳3号为亲本利用EMS诱导突变获得的矮秆多分蘖突变体（编号为D12W191），突变体材料经过4个世代的选育，株系内性状已经稳定。突变体D12W191相对于野生型武育粳3号表现出多蘖、矮秆等特性（图1）。在苗期两者的地上部表型没有显著差异，移栽后45天，两者的分蘖数和株高表现出显著的差异，武育粳3号的平均分蘖数达到24.4±2.1个,株高约为60±3.6cm，而突变体分蘖数多于42.5±4.4个,株高约为43±2.6cm。
图1.武育粳3号与D12W191的株高和分蘖
Fig1. Plant height and tiller numbers of Wuyujing 3 and D12W191
注：WT、mut分别代表野生型武育粳3号和突变体D12W191,下同。
Note：WT and mut represent Wuyujing 3 and D12W191 respectively.
1.2试验处理
本试验于2015年在大学丹阳试验基地玻璃温室进行。8月25播种，9月20选取生长一致的秧苗移栽至装有15kg过筛土的盆钵中，单苗移栽，每盆10苗。在主茎10叶露尖时进行如下处理：（1）、NAA处理，叶面喷施100mg/L的NAA（NAA用少量的无水乙醇溶解后再用清水稀释）；（2）对照（CK），喷施含有与NAA处理相同浓度无水乙醇的清水。
1.3测定项目
a.分蘖芽长度：从处理当天至处理后第4天每天取样一次，取主茎第8叶腋内的分蘖芽，每处理共取20个芽，测量其长度。
b.内源生长素和细胞分裂素含量：在处理0h、6h、12h、24h、36h后，取主茎第8叶腋处的分蘖节及其着生的分蘖芽，液氮速冻后超低温（70℃）保存留待进行激素含量测定。内源生长素、玉米素+玉米素核苷的提取与纯化参考杨建昌等[9]的方法，略有改动。称取0.20.5g新鲜植物材料，加2ml样品提取液（内含1mmol L1BHT的80%甲醇），在冰浴下研磨成匀浆，转入10ml试管，再用2ml提取液分次将研钵冲洗干净，一并转入试管中，摇匀后放置在4℃冰箱中。4℃下提取4h，3500转/min离心8min, 取上清液。沉淀中加1ml提取液，搅匀，置4℃下再提取1h，离心，合并上清液，残渣弃去。上清液过C18固相萃取柱，具体步骤是：80%甲醇（1ml）平衡柱→上样→收集样品→移开样品后用100%甲醇（5ml）洗柱→100%乙醚（5ml）洗柱→100%甲醇（5ml）洗柱→循环。将过柱后的样品转入10ml塑料离心管中，真空浓缩干燥或用氮气吹干，除去提取液中的甲醇，用样品稀释液（100ml pH7.5磷酸缓冲液中加入0.1mlTween20）定容（一般1g鲜重用2ml左右样品稀释液定容）。内源激素含量采用酶联免疫法进行测定，酶联免疫试剂盒购自中国农业大学，具体操作步骤参照试剂盒说明书，使用Spectramax plus型酶标仪测定各浓度标准物及各样品在490nm处的OD值。
c.基因表达分析：在处理0h和6h时，取主茎第8叶腋处的分蘖节及其着生的分蘖芽，液氮速冻后超低温（70℃）保存留待进行基因表达分析，具体方法与基因引物序列如下:
使用E.Z.N.A.? Plant RNA Kit (Omega Biotek, Inc, USA)提取各部位RNA，并除去基因组DNA。提取组织RNA后，用紫外分光光度计测定OD260和OD280，检测RNA质量并计算RNA浓度，检测合格后，按PrimScriptTM RT reagent Kit (Takara, Kyoto, Japan)说明书进行反转录。先按照说明书中所列出的组分配制RT反应液，然后进行反转录，反转录仪器采用美国BioRad公司的PTC0200 DNA Engine Cycler。反转录结束后，使用SYBR Premix Ex TaqTM (Takara, Kyoto, Japan)试剂盒和ABI 7300荧光定量PCR仪进行realtime RTPCR反应，按试剂盒说明书进行操作，先配制RT反应液，再进行Real Time PCR反应，以ACTIN基因作为内标基因，各基因PCR引物序列见下表，所有样品设3次重复,结果采用Deltadelta Ct 法分析。
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