南非赛？属的dna分类研究
摘要：弹尾纲动物俗称跳虫，是一类分布极广、体型甚微的节肢动物，在六足动物及节肢动物中有着其独特的分类学意义。赛?属（Seira）主要分布于热带地区，目前世界上发表的该类群超过170种，但都以形态学为分类依据的，故存在一定的局限性和争议。本课题从分子角度出发，利用分子生物学技术，对目标样品的线粒体COI基因进行比对，并利用ABGD与PTP方法分析构建系统发育树，界定出9个“分子种”。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
1材料与方法 3
1.1实验材料 3
1.2实验仪器和试剂3
1.2.1实验器材3
1.2.2实验试剂3
1.3实验步骤3
1.3.1 DNA的提取3
1.3.2 PCR扩增4
1.3.3电泳4
1.3.4序列编辑5
1.3.5序列分析5
1.4赛?属物种界定方法5
1.4.1 ABGD法5
1.4.2 PTP法5
2结果与分析5
2.1赛?属的DNA分类5
2.1.1 ABGD5
2.1.2 PTP7
2.2综合比较10
3讨论10
致谢10
参考文献10
图1基于Barcoding gap所对应的种内种间差异6
图2最优的种内差异对应的物种数6
图3基于COI序列的boot PTP模型赛?属物种界定，红色对应为同种的簇（Cluster）8
图4基于COI序列的b PTP模型赛?属物种界定，红色对应为同种的簇（Cluster）9
表1本文所用分子标记、引物、文献来源等信息4
表2不同分割点所界定出的组别数7
南非赛?属的DNA分类研究
引言
引言
弹尾虫（Collembola），因腹面着生有腹管与弹器，又被称之为跳虫，简称?。其分布广泛，适应于各种陆生环境，为三大土壤动物（线虫、螨、跳虫）之一。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
他们对腐败植物具有直接分解作用，并对真菌的分布与生长产生间接的影响，因此成为土壤中重要的功能类群之一[1]。长期以来，跳虫的单系性受到了学者们的普遍认可，并将其划分为六足总纲下的一个纲——弹尾纲。
赛?属（Seira）主要分布于热带和亚热带地区，目前已发表了170余种。由于Yoshii和Suhardjono曾发表的基于非洲和亚洲种群的亚属分类并不适用于其它种群，所以我们还尚未对跳虫的亚属进行分类[2]。早期赛?属的分类是以一些有疑问的形态学特征为分类依据的，例如非圆齿形长爪和体色等。后来，Coates[3]和Jacquemart[4]发展了该类群的分类特征，但Coates文章中的分类依据只适用于非洲种群，依然存在一定的局限性，Jacquemart的文章则适用于更广泛的描述。而后许多描述毛序的文章相继发表，其中较有代表性的是Mari Mutt[5]、Christiansen和Bellinger[6]的文章。
赛?属主要分布于非洲以及拉美地区，在已发表的种群当中，非洲68种（43%），拉美44种（28%），印第安12种（8%），欧洲7种，地中海8种（6%），东南亚2种，6个广布种。剩余的17个种散布于南极洲的陆地与岛屿上。这些种集中分布于拉美、非洲、印第安和地中海这些冈瓦纳大陆，但是澳大利亚地区却没有当地种，该地区描述过的两个种是引进种，新西兰发表的为一个可疑种。
DNA分类尤其是条形码技术在过去10年里快速发展[7]，能够帮助非分类专家有效进行物种区分和鉴定[8]。通过DNA条码分析能够帮助我们解决一些形态分类无法解决的问题，例如通过进化分析，我们能够得知出现在澳大利亚和新西兰的种群起源于侏罗纪晚期，印第安的种群可能是由从非洲迁移而来。
本课题即从DNA分类的角度出发，以线粒体COI基因为标记基因，借助ABGD和PTP方法对赛跳属的部分种进行初步界定。本研究将一改以往赛?属分类研究局限于多样性调查及物种简单描述的局面，充分获取材料，同时使用形态和分子数据对赛?属进行系统发育研究，从线粒体基因组角度探索赛?属在弹尾纲中的真实地位，将分类、系统发育、性状演化有机地结合起来去看待类群的进化历程。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．2 实验仪器和试剂
1．2．1 实验器材
PCR扩增仪：TC5000；
台式高速离心机：Centrifuge 5418；
电泳仪：北京六一仪器厂DYY6型；
高压灭菌锅；
数显恒温水浴箱：HH2；
电子精密天平:北京赛多利斯天平有限公司；
耗材：枪头、离心管、PCR扩增管；（上海生工）；
紫外分析仪：JY03型；
1．2．2 实验试剂
Proteinase K（上海生工）；
EasyTaq 5U∕μl（全式金）；
分子量标准物（6×Loading Buffer）（上海生工）；
Ezup柱式动物基因组DNA 抽提试剂盒（上海生工）；
溴化乙锭（EB）；琼脂糖；TBE；
1．3实验步骤
1．3．1 DNA的提取
本实验使用的的模版DNA是来自上海生工Ezup（Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit）柱式动物基因组DNA抽提试剂盒提取，具体步骤如下：
1）取一整只?虫置于灭菌的1.5ml离心管中，加入Buffer ACL 180ul，再加入蛋白酶K 20ul，震荡摇匀，56°C恒温水浴13h。
2）加入Buffer CL 200ul，充分颠倒混匀。如有沉淀产生，可70℃水浴10min。
3）加入无水乙醇200ul，充分颠倒混匀。
4）将吸附柱放入收集管中，用移液枪将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，此过程应注意，将样本壳留在原1.5ml离心管中，加入适量75%酒精溶液，保存于20°C冰箱中用于形态学研究。吸附柱静置2min后，再以10,000 rpm室温离心1min，倒尽收集管中的废液。
5）将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入CW1 Solution 500ul，以10,000 rpm室温离心30s，倒尽收集管中的废液。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
1材料与方法 3
1.1实验材料 3
1.2实验仪器和试剂3
1.2.1实验器材3
1.2.2实验试剂3
1.3实验步骤3
1.3.1 DNA的提取3
1.3.2 PCR扩增4
1.3.3电泳4
1.3.4序列编辑5
1.3.5序列分析5
1.4赛?属物种界定方法5
1.4.1 ABGD法5
1.4.2 PTP法5
2结果与分析5
2.1赛?属的DNA分类5
2.1.1 ABGD5
2.1.2 PTP7
2.2综合比较10
3讨论10
致谢10
参考文献10
图1基于Barcoding gap所对应的种内种间差异6
图2最优的种内差异对应的物种数6
图3基于COI序列的boot PTP模型赛?属物种界定，红色对应为同种的簇（Cluster）8
图4基于COI序列的b PTP模型赛?属物种界定，红色对应为同种的簇（Cluster）9
表1本文所用分子标记、引物、文献来源等信息4
表2不同分割点所界定出的组别数7
南非赛?属的DNA分类研究
引言
引言
弹尾虫（Collembola），因腹面着生有腹管与弹器，又被称之为跳虫，简称?。其分布广泛，适应于各种陆生环境，为三大土壤动物（线虫、螨、跳虫）之一。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
他们对腐败植物具有直接分解作用，并对真菌的分布与生长产生间接的影响，因此成为土壤中重要的功能类群之一[1]。长期以来，跳虫的单系性受到了学者们的普遍认可，并将其划分为六足总纲下的一个纲——弹尾纲。
赛?属（Seira）主要分布于热带和亚热带地区，目前已发表了170余种。由于Yoshii和Suhardjono曾发表的基于非洲和亚洲种群的亚属分类并不适用于其它种群，所以我们还尚未对跳虫的亚属进行分类[2]。早期赛?属的分类是以一些有疑问的形态学特征为分类依据的，例如非圆齿形长爪和体色等。后来，Coates[3]和Jacquemart[4]发展了该类群的分类特征，但Coates文章中的分类依据只适用于非洲种群，依然存在一定的局限性，Jacquemart的文章则适用于更广泛的描述。而后许多描述毛序的文章相继发表，其中较有代表性的是Mari Mutt[5]、Christiansen和Bellinger[6]的文章。
赛?属主要分布于非洲以及拉美地区，在已发表的种群当中，非洲68种（43%），拉美44种（28%），印第安12种（8%），欧洲7种，地中海8种（6%），东南亚2种，6个广布种。剩余的17个种散布于南极洲的陆地与岛屿上。这些种集中分布于拉美、非洲、印第安和地中海这些冈瓦纳大陆，但是澳大利亚地区却没有当地种，该地区描述过的两个种是引进种，新西兰发表的为一个可疑种。
DNA分类尤其是条形码技术在过去10年里快速发展[7]，能够帮助非分类专家有效进行物种区分和鉴定[8]。通过DNA条码分析能够帮助我们解决一些形态分类无法解决的问题，例如通过进化分析，我们能够得知出现在澳大利亚和新西兰的种群起源于侏罗纪晚期，印第安的种群可能是由从非洲迁移而来。
本课题即从DNA分类的角度出发，以线粒体COI基因为标记基因，借助ABGD和PTP方法对赛跳属的部分种进行初步界定。本研究将一改以往赛?属分类研究局限于多样性调查及物种简单描述的局面，充分获取材料，同时使用形态和分子数据对赛?属进行系统发育研究，从线粒体基因组角度探索赛?属在弹尾纲中的真实地位，将分类、系统发育、性状演化有机地结合起来去看待类群的进化历程。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．2 实验仪器和试剂
1．2．1 实验器材
PCR扩增仪：TC5000；
台式高速离心机：Centrifuge 5418；
电泳仪：北京六一仪器厂DYY6型；
高压灭菌锅；
数显恒温水浴箱：HH2；
电子精密天平:北京赛多利斯天平有限公司；
耗材：枪头、离心管、PCR扩增管；（上海生工）；
紫外分析仪：JY03型；
1．2．2 实验试剂
Proteinase K（上海生工）；
EasyTaq 5U∕μl（全式金）；
分子量标准物（6×Loading Buffer）（上海生工）；
Ezup柱式动物基因组DNA 抽提试剂盒（上海生工）；
溴化乙锭（EB）；琼脂糖；TBE；
1．3实验步骤
1．3．1 DNA的提取
本实验使用的的模版DNA是来自上海生工Ezup（Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit）柱式动物基因组DNA抽提试剂盒提取，具体步骤如下：
1）取一整只?虫置于灭菌的1.5ml离心管中，加入Buffer ACL 180ul，再加入蛋白酶K 20ul，震荡摇匀，56°C恒温水浴13h。
2）加入Buffer CL 200ul，充分颠倒混匀。如有沉淀产生，可70℃水浴10min。
3）加入无水乙醇200ul，充分颠倒混匀。
4）将吸附柱放入收集管中，用移液枪将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，此过程应注意，将样本壳留在原1.5ml离心管中，加入适量75%酒精溶液，保存于20°C冰箱中用于形态学研究。吸附柱静置2min后，再以10,000 rpm室温离心1min，倒尽收集管中的废液。
5）将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入CW1 Solution 500ul，以10,000 rpm室温离心30s，倒尽收集管中的废液。
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