稻曲病菌tdna随机插入突变体的致病性检测和突变位点分析
摘要：本实验以稻曲病菌T-DNA插入突变病菌为研究对象，首先用人工注射接种的方法，将突变体的菌丝和孢子混合培养液田间接种水稻感病品种两优培九，检测部分突变菌株在水稻上的致病性。然后根据致病性检测结果，筛选一株致病性减弱的稻曲病菌突变体进行深入研究：通过Southern杂交分析突变体T-DNA的插入拷贝数，运用TAIL-PCR技术获得T-DNA插入位点的侧翼序列，从而明确该突变体的突变位点及突变基因，为稻曲病菌致病相关基因的克隆和致病机制研究提供基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1.材料与方法2
1.1.材料2
1.1.1.供试菌株2
1.1.2.供试接种水稻品种2
1.1.3.供试培养基2
1.1.4.引物及试剂2
1.2.实验方法2
1.2.1.病菌培养和接种菌体准备2
1.2.2.致病力分析3
1.3.突变体B1421的TDNA的分子测定3
1.3.1. CTAB法提取基因组TDNA3
1.3.2.TDNA在突变体B1421侧翼序列的扩增 3
1.3.3.PCR反应体系 4
1.3.4.PCR反应条件 5
2.结果与分析6
2.1.B1412的致病性测定 6
2.2.B1412的致病性测定 6
2.3. B1412中TDNA插入拷贝数分析7
2.4. B1412中TDNA侧翼序列的扩增7
讨论 8
致谢8
参考文献9 稻曲病菌TDNA随机插入突变体的致病性检测和突变位点分析
引言
引言：水稻稻曲病又称为黑穗病、绿黑穗病、谷花病、青粉病等，俗称“丰产果”，是由稻曲病菌（Ustilaginoidea virens(cooke)Tak.)侵染引发的水稻穗部病害，是世界性水稻病害之一[1]。该病害自 19世纪 80 年代在印度首次发现以来，一直被认为是一种水稻次生病害[2]。但20世纪80年代以后，水稻稻曲病在中
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
国的发生频率增高，危害日益严重，由过去水稻的次生性病害逐步发展成为目前水稻生产上仅次于水稻稻瘟病、纹枯病之后的又一大真菌性病害[3]，在一些水稻产区甚至已上升为主要病害。由于稻曲病的发生不仅造成水稻减产，且会使稻米品质下降[4]，因此现已引起各国植物保护学者的高度重视，并开展了一系列深入细致地研究工作。对稻曲病的研究，目前多侧重于稻曲病菌的生物学特性、防治、毒素及侵染等方面，而在稻曲病菌致病相关基因的研究方面尚不深入。本实验的致病性测定是采用人工注射接种的方式，研究不同稻曲病菌TDNA插入突变株在水稻上的致病力。为了使接种后发病时的稳定性和发病效果更显著，每个菌体接种多穗，并重复多次，设置对照组，对测定的致病性进行比较。突变位点通过Southern杂交和TAILPCR来研究，分析致病性变化突变体的TDNA拷贝数和插入位点,再根据TDNA侧翼序列结合稻曲病菌基因组信息，比对基因的信息，预测基因功能。
1.材料与方法
1.1.材料
1.1.1.供试菌株
稻曲病菌野生型菌株P1、突变体菌株为以P1为出发菌株，经农杆菌介导的遗传转化获得的稻曲病菌突变体库中突变菌株，菌株均由江苏省农科院植物保护所实验室分离及保存。
1.1.2.供试接种水稻品种
水稻稻曲病感病品种两优培九。
1.1.3.供试培养基
(1)马铃薯蔗糖培养基( PSA):马铃薯200g煮沸后的过滤液、蔗糖20g、琼脂18g、加水定容至1L。
(2)马铃薯蔗糖液体培养基(PS):马铃薯200g煮沸后的过滤液、蔗糖20g、加水定容至1L。
1.1.4.引物及试剂
PCR试剂盒、T载体连接试剂盒和感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。限制性内切酶EcoRⅠ、PCR所用的各种Taq DNA聚合酶、DNA Marker 购自TaKaRa公司。胶回收试剂盒购自广东东盛生物科技有限公司。Southern 杂交试剂盒DIG High Primer Labeling and Detecting Starter KitⅠ试剂盒购自Roche公司，杂交用的带正电和的尼龙膜购自上海索莱宝生物科技有限公司。Kanamycin购自于SIGMA公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2.实验方法
1.2.1.病菌培养和接种菌体准备
将70℃保存的突变体病菌株活化到含有抗生素（卡那50mg/L)的无菌PSA培养基上培养。培养5天，待长出菌丝后，挑取菌丝转接到PDA培养基上继续培养12天左右。用打孔器（直径为3.5 mm）取菌碟9粒接到含15 mL PS培养液的50mL离心管中，28℃，150r/min恒温摇培[5]。培养7天后，用粉碎机将培养菌液粉碎处理制成菌丝片段与分生孢子的混合液。用PS培养液将粉碎后的菌丝孢子液调成分生孢子浓度为1×106个/mL的接种液。(孢子接种量用血球计数器计数)。
1.2.2.致病力分析
将水稻进行常规的浸种、消毒和育苗后，种植在水泥池中，并进行常规的栽培和管理。稻曲病接种菌液于水稻孕穗期间采取注射接种方法[6]，接种时间为水稻破口前57天，接种部位为水稻穗苞中部，接种时注射器针头需向下倾斜与穗苞略成45℃夹角，将接种液每株1mL从侧面注射入穗苞。以注射菌液P1作为稻株的对照组,每个菌株注射10穗，重复3次，接种后做上标记。水稻人工注射接种稻曲病菌21天以后，割下所有的稻穗，调查接种穗发病的病粒数。
1.3. 突变体B1421的TDNA的分子测定
接种菌丝块接种于50 ml PS培养液中，28℃，150r/min振荡培养5天后，用滤纸收集菌丝体，采用CTAB法提取菌株基因组DNA[7]。以P1为对照，通过电泳检测确定DNA的浓度。将基因组DNA做TAILPCR，克隆突变体中TDNA的侧翼序列，再进行胶回收并测序。Southern杂交实验具体操作步骤参照Roche试剂盒提供的方法进行，分析突变体的TDNA拷贝数 [8]。基因组内切酶用EcoRⅠ，使用的探针为DIG标记的潮霉素抗性基因片段，使用终浓度为25 ng/mL。
1.3.1. CTAB法提取基因组TDNA
(1) 将过滤收集到的菌丝用吸水纸吸干后，取适量于研钵中，加液氮研磨成粉末状；
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1.材料与方法2
1.1.材料2
1.1.1.供试菌株2
1.1.2.供试接种水稻品种2
1.1.3.供试培养基2
1.1.4.引物及试剂2
1.2.实验方法2
1.2.1.病菌培养和接种菌体准备2
1.2.2.致病力分析3
1.3.突变体B1421的TDNA的分子测定3
1.3.1. CTAB法提取基因组TDNA3
1.3.2.TDNA在突变体B1421侧翼序列的扩增 3
1.3.3.PCR反应体系 4
1.3.4.PCR反应条件 5
2.结果与分析6
2.1.B1412的致病性测定 6
2.2.B1412的致病性测定 6
2.3. B1412中TDNA插入拷贝数分析7
2.4. B1412中TDNA侧翼序列的扩增7
讨论 8
致谢8
参考文献9 稻曲病菌TDNA随机插入突变体的致病性检测和突变位点分析
引言
引言：水稻稻曲病又称为黑穗病、绿黑穗病、谷花病、青粉病等，俗称“丰产果”，是由稻曲病菌（Ustilaginoidea virens(cooke)Tak.)侵染引发的水稻穗部病害，是世界性水稻病害之一[1]。该病害自 19世纪 80 年代在印度首次发现以来，一直被认为是一种水稻次生病害[2]。但20世纪80年代以后，水稻稻曲病在中
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
国的发生频率增高，危害日益严重，由过去水稻的次生性病害逐步发展成为目前水稻生产上仅次于水稻稻瘟病、纹枯病之后的又一大真菌性病害[3]，在一些水稻产区甚至已上升为主要病害。由于稻曲病的发生不仅造成水稻减产，且会使稻米品质下降[4]，因此现已引起各国植物保护学者的高度重视，并开展了一系列深入细致地研究工作。对稻曲病的研究，目前多侧重于稻曲病菌的生物学特性、防治、毒素及侵染等方面，而在稻曲病菌致病相关基因的研究方面尚不深入。本实验的致病性测定是采用人工注射接种的方式，研究不同稻曲病菌TDNA插入突变株在水稻上的致病力。为了使接种后发病时的稳定性和发病效果更显著，每个菌体接种多穗，并重复多次，设置对照组，对测定的致病性进行比较。突变位点通过Southern杂交和TAILPCR来研究，分析致病性变化突变体的TDNA拷贝数和插入位点,再根据TDNA侧翼序列结合稻曲病菌基因组信息，比对基因的信息，预测基因功能。
1.材料与方法
1.1.材料
1.1.1.供试菌株
稻曲病菌野生型菌株P1、突变体菌株为以P1为出发菌株，经农杆菌介导的遗传转化获得的稻曲病菌突变体库中突变菌株，菌株均由江苏省农科院植物保护所实验室分离及保存。
1.1.2.供试接种水稻品种
水稻稻曲病感病品种两优培九。
1.1.3.供试培养基
(1)马铃薯蔗糖培养基( PSA):马铃薯200g煮沸后的过滤液、蔗糖20g、琼脂18g、加水定容至1L。
(2)马铃薯蔗糖液体培养基(PS):马铃薯200g煮沸后的过滤液、蔗糖20g、加水定容至1L。
1.1.4.引物及试剂
PCR试剂盒、T载体连接试剂盒和感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。限制性内切酶EcoRⅠ、PCR所用的各种Taq DNA聚合酶、DNA Marker 购自TaKaRa公司。胶回收试剂盒购自广东东盛生物科技有限公司。Southern 杂交试剂盒DIG High Primer Labeling and Detecting Starter KitⅠ试剂盒购自Roche公司，杂交用的带正电和的尼龙膜购自上海索莱宝生物科技有限公司。Kanamycin购自于SIGMA公司。其他试剂均为国产分析纯。
1.2.实验方法
1.2.1.病菌培养和接种菌体准备
将70℃保存的突变体病菌株活化到含有抗生素（卡那50mg/L)的无菌PSA培养基上培养。培养5天，待长出菌丝后，挑取菌丝转接到PDA培养基上继续培养12天左右。用打孔器（直径为3.5 mm）取菌碟9粒接到含15 mL PS培养液的50mL离心管中，28℃，150r/min恒温摇培[5]。培养7天后，用粉碎机将培养菌液粉碎处理制成菌丝片段与分生孢子的混合液。用PS培养液将粉碎后的菌丝孢子液调成分生孢子浓度为1×106个/mL的接种液。(孢子接种量用血球计数器计数)。
1.2.2.致病力分析
将水稻进行常规的浸种、消毒和育苗后，种植在水泥池中，并进行常规的栽培和管理。稻曲病接种菌液于水稻孕穗期间采取注射接种方法[6]，接种时间为水稻破口前57天，接种部位为水稻穗苞中部，接种时注射器针头需向下倾斜与穗苞略成45℃夹角，将接种液每株1mL从侧面注射入穗苞。以注射菌液P1作为稻株的对照组,每个菌株注射10穗，重复3次，接种后做上标记。水稻人工注射接种稻曲病菌21天以后，割下所有的稻穗，调查接种穗发病的病粒数。
1.3. 突变体B1421的TDNA的分子测定
接种菌丝块接种于50 ml PS培养液中，28℃，150r/min振荡培养5天后，用滤纸收集菌丝体，采用CTAB法提取菌株基因组DNA[7]。以P1为对照，通过电泳检测确定DNA的浓度。将基因组DNA做TAILPCR，克隆突变体中TDNA的侧翼序列，再进行胶回收并测序。Southern杂交实验具体操作步骤参照Roche试剂盒提供的方法进行，分析突变体的TDNA拷贝数 [8]。基因组内切酶用EcoRⅠ，使用的探针为DIG标记的潮霉素抗性基因片段，使用终浓度为25 ng/mL。
1.3.1. CTAB法提取基因组TDNA
(1) 将过滤收集到的菌丝用吸水纸吸干后，取适量于研钵中，加液氮研磨成粉末状；
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