辣椒疫霉效应因子rxlr22的鉴定及功能初步研究
摘要：疫霉菌分泌大量的效应因子干扰寄主植物细胞的生理和功能。RxLR效应因子是一类重要的疫霉菌胞内效应因子，它们可以转运进入植物细胞来干扰寄主的防卫反应，促进病原菌的侵染。本实验利用辣椒疫霉菌-本氏烟模式互作模式体系，从辣椒疫霉菌中克隆了5个RxLR效应因子，并利用农杆菌介导的植物瞬时表达技术，鉴定到了一个能够在本氏烟叶片上引起强烈细胞死亡的效应因子RxLR22；实时定量PCR分析结果表明RxLR22在侵染前期下调表达，侵染后期上调表达，表明该效应因子可能在病原菌侵染后期发挥作用；接种实验结果表明在本氏烟叶片中表达RxLR22不能够显著促进辣椒疫霉菌的侵染；亚细胞定位分析结果表明该效应因子在细胞质和细胞核均有分布。以上研究结果为进一步解析RxLR22的功能及作用机制奠定了基础，为认识疫霉菌的致病机制提供了线索。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
1材料与方法3
1.1材料 3
1.1.1供试植物、菌株3
1.1.2培养基的制备3
1.2方法 4
1.2.1辣椒疫霉RxLR22效应因子的克隆及重组载体的构建4
1.2.2大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备4
1.2.3大肠杆菌的转化5
1.2.4农杆菌GV3101感受态细胞的制备5
1.2.5 农杆菌的电击转化5
1.2.6 农杆菌介导的瞬时表达以及亚细胞定位5
1.2.7 辣椒疫霉侵染阶段样品制备6
1.2.8本氏烟病组织RNA提取6
1.2.9 RealTime PCR分析6
1.2.10 游动孢子诱导6
2 结果与分析7
2.1 RxLR22效应因子可以在本氏烟上引发细胞死亡7
2.2 RxLR22效应因子在辣椒疫霉菌侵染后期上调表达7
2.3 在本氏烟中表达RxLR22效应因子不能促进辣椒疫霉侵染8
2.4 RxLR22在本氏烟细胞质及细胞核均有分布8
3讨论 9
致谢10
参考
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
文献10
辣椒疫霉效应因子RxLR22的鉴定及功能初步研究
引言
卵菌(Oomycetes)是一类形态上与真菌相似，但进化上与真菌不同的特殊微生物[1]。其中疫霉菌(Phytophthora)、腐霉菌(Pythium)、霜霉菌(Downy mildew)等均是重要植物病原菌，引起多种毁灭性植物病害，在全球范围内造成巨大的经济损失。绝大多数疫霉菌(Phytophthora)属于半活体营养菌，在活体营养阶段，疫霉菌抑制植物的程序化细胞死亡和防卫反应，从而实现侵染和定殖[2]。辣椒疫霉(P. capsici)寄主范围广，每年都造成巨大的经济损失且呈连年增加趋势，同时还能侵染模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)和本氏烟(Nicotiana benthamiana)，已经成为卵菌研究的重要模式材料[3, 4]。
植物病原菌分泌效应因子(effector)干扰细胞的生理和功能，从而促进自身的侵染和定殖[5]。目前，己经有数个疫霉菌的全基因组完成测序，其中包括致病疫霉菌(P. infestans)[6]、大豆疫霉菌(P. sojae)[7]、橡树疫霉菌(P. ramorum)、辣椒疫霉菌(P. capsici)[8]、寄生疫霉菌(P. parasitica)等。基因组分析发现疫霉菌可以编码数量庞大的效应因子，根据这些效应分子在寄主中靶标位置不同，可将其分为两类：质外体效应分子(apoplastic effectors)和细胞质效应分子(cytoplasmic effectors)[9]。质外体效应分子被分泌到细胞外空间，在植物细胞外发挥作用；而细胞质效应分子能够通过某种机制转运到寄主植物细胞内干扰植物的防卫反应。
疫霉菌胞内效应因子主要包括RxLR和Crinkler (CRN) 两类。其中RxLR效应因子蛋白序列氮端有一段保守的RxLR（R，精氨酸；x，任意氨基酸；L，亮氨酸；R，精氨酸）蛋白基序，负责将效应因子转运到寄主植物细胞[10, 11]。当寄主植物中含有与效应因子对应的抗病蛋白(resistance protein, R protein)时，效应因子可被寄主植物识别，激发效应子触发的免疫反应(effectortriggered immunity, ETI)，此时的效应子称为无毒蛋白(avirulence protein, Avr)[12]。目前卵菌中鉴定的无毒蛋白几乎全部为RxLR类效应因子，例如致病疫霉菌中的PiAvr3a和大豆疫霉的PsAvrlb等[13]。而当寄主植物中不含有相应抗病蛋白时，效应因子往往可以抑制植物的防卫反应，促进病原菌的侵染。近年来已经揭示了数个疫霉菌RxLR效应因子的毒性功能[1417]。
前人的研究表明疫霉菌RxLR效应因子有调控植物细胞死亡的功能[18, 19]，在病原菌侵染早期，疫霉菌分泌效应因子抑制的细胞死亡，促进病原菌的侵入；而在疫霉菌侵染后期，病原菌分泌效应因子杀死寄主植物，从而帮助病原菌过渡到死体营养阶段。病原菌可能通过调控效应因子的顺序表达实现了其营养类型的转换[20]。然而我们对调节的具体机制还知之甚少。致病疫霉菌通过在侵染早期分泌SNE1效应因子，抑制寄主植物的细胞程序化死亡，从而促进病原菌的侵染[2]。大豆疫霉菌Avh241定位在植物细胞膜，可以诱导植物的细胞死亡[14]，然而其是否在病原菌过渡到死体营养过程中发挥作用尚不明确。
本研究利用辣椒疫霉菌本氏烟模式互作模式体系，从辣椒疫霉菌中克隆了5个辣椒疫霉菌RxLR效应因子，并利用农杆菌介导的植物瞬时表达技术鉴定到一个能够在本氏烟叶片上诱导细胞死亡的效应因子RxLR22；实时定量PCR分析表明RxLR22在侵染前期下调表达，侵染后期上调表达，表明RxLR22可能在疫霉菌活体营养到死体营养转换过程中发挥重要功能；接种实验表明，在本氏烟叶片中表达RxLR22不能够显著的促进病原菌的侵染；亚细胞定位结果表明，RxLR22在细胞质和细胞核均有分布。以上实验结果为进一步解析RxLR22的功能奠定了基础，为认识疫霉菌的致病机制提供线索。
材料与方法
1.1材料
1.1.1供试植物、菌株
供试本氏烟(Nicotiana benthamiana)在25 ℃， 16 h/8 h光暗交替培养68周待用。
大肠杆菌(Eschrichia coli)菌株DH5α、农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101为本实验室保存。
辣椒疫霉LT263为本实验室保存，在10 % V8固体培养基上，25 ℃，黑暗条件培养。
1.1.2 培养基的制备
LB培养基：10 g蛋白胨，5 g酵母提取物，10 g NaCl，纯水定容至1 L。
V8培养基的配制：100 ml V8汁，1 %碳酸钙，纯水定容至1 L。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
1材料与方法3
1.1材料 3
1.1.1供试植物、菌株3
1.1.2培养基的制备3
1.2方法 4
1.2.1辣椒疫霉RxLR22效应因子的克隆及重组载体的构建4
1.2.2大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备4
1.2.3大肠杆菌的转化5
1.2.4农杆菌GV3101感受态细胞的制备5
1.2.5 农杆菌的电击转化5
1.2.6 农杆菌介导的瞬时表达以及亚细胞定位5
1.2.7 辣椒疫霉侵染阶段样品制备6
1.2.8本氏烟病组织RNA提取6
1.2.9 RealTime PCR分析6
1.2.10 游动孢子诱导6
2 结果与分析7
2.1 RxLR22效应因子可以在本氏烟上引发细胞死亡7
2.2 RxLR22效应因子在辣椒疫霉菌侵染后期上调表达7
2.3 在本氏烟中表达RxLR22效应因子不能促进辣椒疫霉侵染8
2.4 RxLR22在本氏烟细胞质及细胞核均有分布8
3讨论 9
致谢10
参考
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
文献10
辣椒疫霉效应因子RxLR22的鉴定及功能初步研究
引言
卵菌(Oomycetes)是一类形态上与真菌相似，但进化上与真菌不同的特殊微生物[1]。其中疫霉菌(Phytophthora)、腐霉菌(Pythium)、霜霉菌(Downy mildew)等均是重要植物病原菌，引起多种毁灭性植物病害，在全球范围内造成巨大的经济损失。绝大多数疫霉菌(Phytophthora)属于半活体营养菌，在活体营养阶段，疫霉菌抑制植物的程序化细胞死亡和防卫反应，从而实现侵染和定殖[2]。辣椒疫霉(P. capsici)寄主范围广，每年都造成巨大的经济损失且呈连年增加趋势，同时还能侵染模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)和本氏烟(Nicotiana benthamiana)，已经成为卵菌研究的重要模式材料[3, 4]。
植物病原菌分泌效应因子(effector)干扰细胞的生理和功能，从而促进自身的侵染和定殖[5]。目前，己经有数个疫霉菌的全基因组完成测序，其中包括致病疫霉菌(P. infestans)[6]、大豆疫霉菌(P. sojae)[7]、橡树疫霉菌(P. ramorum)、辣椒疫霉菌(P. capsici)[8]、寄生疫霉菌(P. parasitica)等。基因组分析发现疫霉菌可以编码数量庞大的效应因子，根据这些效应分子在寄主中靶标位置不同，可将其分为两类：质外体效应分子(apoplastic effectors)和细胞质效应分子(cytoplasmic effectors)[9]。质外体效应分子被分泌到细胞外空间，在植物细胞外发挥作用；而细胞质效应分子能够通过某种机制转运到寄主植物细胞内干扰植物的防卫反应。
疫霉菌胞内效应因子主要包括RxLR和Crinkler (CRN) 两类。其中RxLR效应因子蛋白序列氮端有一段保守的RxLR（R，精氨酸；x，任意氨基酸；L，亮氨酸；R，精氨酸）蛋白基序，负责将效应因子转运到寄主植物细胞[10, 11]。当寄主植物中含有与效应因子对应的抗病蛋白(resistance protein, R protein)时，效应因子可被寄主植物识别，激发效应子触发的免疫反应(effectortriggered immunity, ETI)，此时的效应子称为无毒蛋白(avirulence protein, Avr)[12]。目前卵菌中鉴定的无毒蛋白几乎全部为RxLR类效应因子，例如致病疫霉菌中的PiAvr3a和大豆疫霉的PsAvrlb等[13]。而当寄主植物中不含有相应抗病蛋白时，效应因子往往可以抑制植物的防卫反应，促进病原菌的侵染。近年来已经揭示了数个疫霉菌RxLR效应因子的毒性功能[1417]。
前人的研究表明疫霉菌RxLR效应因子有调控植物细胞死亡的功能[18, 19]，在病原菌侵染早期，疫霉菌分泌效应因子抑制的细胞死亡，促进病原菌的侵入；而在疫霉菌侵染后期，病原菌分泌效应因子杀死寄主植物，从而帮助病原菌过渡到死体营养阶段。病原菌可能通过调控效应因子的顺序表达实现了其营养类型的转换[20]。然而我们对调节的具体机制还知之甚少。致病疫霉菌通过在侵染早期分泌SNE1效应因子，抑制寄主植物的细胞程序化死亡，从而促进病原菌的侵染[2]。大豆疫霉菌Avh241定位在植物细胞膜，可以诱导植物的细胞死亡[14]，然而其是否在病原菌过渡到死体营养过程中发挥作用尚不明确。
本研究利用辣椒疫霉菌本氏烟模式互作模式体系，从辣椒疫霉菌中克隆了5个辣椒疫霉菌RxLR效应因子，并利用农杆菌介导的植物瞬时表达技术鉴定到一个能够在本氏烟叶片上诱导细胞死亡的效应因子RxLR22；实时定量PCR分析表明RxLR22在侵染前期下调表达，侵染后期上调表达，表明RxLR22可能在疫霉菌活体营养到死体营养转换过程中发挥重要功能；接种实验表明，在本氏烟叶片中表达RxLR22不能够显著的促进病原菌的侵染；亚细胞定位结果表明，RxLR22在细胞质和细胞核均有分布。以上实验结果为进一步解析RxLR22的功能奠定了基础，为认识疫霉菌的致病机制提供线索。
材料与方法
1.1材料
1.1.1供试植物、菌株
供试本氏烟(Nicotiana benthamiana)在25 ℃， 16 h/8 h光暗交替培养68周待用。
大肠杆菌(Eschrichia coli)菌株DH5α、农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101为本实验室保存。
辣椒疫霉LT263为本实验室保存，在10 % V8固体培养基上，25 ℃，黑暗条件培养。
1.1.2 培养基的制备
LB培养基：10 g蛋白胨，5 g酵母提取物，10 g NaCl，纯水定容至1 L。
V8培养基的配制：100 ml V8汁，1 %碳酸钙，纯水定容至1 L。
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