滞育灰飞虱中激素合成酶基因的表达动态
摘要：滞育灰飞虱体内激素合成酶基因的相对表达量的变化规律通过荧光定量PCR的方法对合成保幼激素以及蜕皮激素关键酶JHAMT、CYP15A1、CYP307A1、CYP306A1、CYP314A1这五个基因的相对表达量进行测定，以期初步探讨激素对灰飞虱若虫滞育的调节机制。滞育期间灰飞虱体内与保幼激素合成相关的JHAMT基因的表达量显著升高，而与蜕皮激素合成相关的CYP307A1、CYP306A1基因的表达量显著下降，并且在这三个基因的表达量回调时，滞育的若虫开始大量以及连续的蜕皮。通过此结果我们明确灰飞虱的滞育与保幼激素和蜕皮激素存在着密切的关系，受到保幼激素以及蜕皮激素的调控。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法4
1.1 供试昆虫 4
1.2 滞育与非滞育灰飞虱目标基因龄期的特异性表达4
1.3 实时荧光定量PCR4
1.3.1实时荧光定量PCR引物设计4
1.3.2实时荧光定量PCR反应体系5
1.3.3灰飞虱目标基因表达量分析5
1.4数据统计方法6
2结果与分析6
2.1灰飞虱体内JHAMT和CYP15A1基因表达量的变化6
2.2 灰飞虱体内Halloween基因表达量的变化 7
2.3 灰飞虱体内不同基因表达量的变化与若虫蜕皮时间之间的关系 8
3讨论9
3.1 激素对灰飞虱滞育的调控9
致谢11
参考文献11
图1 滞育与非滞育灰飞虱不同天数（时间）靶基因JHAMT的相对表达量6
图2滞育与非滞育灰飞虱不同天数（时间）靶基因cyp15a1的相对表达量 7
图3滞育与非滞育灰飞虱不同天数（时间）靶基因cyp307a1的相对表达量7
图4滞育与非滞育灰飞虱不同天数（时间）靶基因cyp306a1的相对表达量8
图5滞育与非滞育灰飞虱不同天数（时间）靶基因cyp314a1的相对表达量8
图6 灰飞虱体内激素合成酶的表达量与若虫蜕
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
皮时间的关系9
表1 定量引物名称及序列5
滞育灰飞虱中激素合成酶基因的表达动态
引言
目前已知调控昆虫蜕皮与变态的激素主要有保幼激素(juvenilehormone, JH) 和蜕皮激素(molting hormone)两大类， 两者协同作用调控基因网络的级联反应和相互作用。蜕皮激素调控昆虫的蜕皮与变态，保幼激素抑制蜕皮激素调节的各种分子活动，控制昆虫的蜕皮。在幼虫取食期，保幼激素存在时，蜕皮激素启动幼虫不同龄期间的蜕皮；在变态期，保幼激素滴度降低或消失时，蜕皮激素启动变态蜕皮。
激素缺乏学说和保幼激素(JH)调节论，是两种对昆虫进入滞育的解释。激素缺乏学说用于解释蛹滞育的内分泌基础，其认为当幼虫大脑神经(NS)系统变为不活动、心侧体(CC)停止分泌促蜕皮激素时，昆虫便开始滞育；当心侧体重新开始释放促蜕皮激素后，幼虫形态变化才恢复。保幼激素调节论提出滞育幼虫与滞育蛹不同，咽侧体(CA)保持活跃分泌保幼激素，保幼激素通过调节蜕皮激素(MH)的分泌来诱导以及维持滞育。
保幼激素甲基转移酶（JHAMT）是保幼激素合成过程中重要的调控酶，它可以转移S 腺苷 L 蛋氨酸（SAM）中的一个甲基到保幼激素前体中，从而在咽侧体中产生有活性的保幼激素，研究发现果蝇发育过程中JHAMT的表达模式与保幼激素滴度的变化基本一致[1]。
Helvig等[2] 从太平洋折翅蠊 Diploptera punctata 咽侧体的 900 多条 ESTs 中拼接出一条P450基因序列，被命名为CYP15A1，该基因与果蝇的 P450 还原酶等组成重组酶系，能将2 E 6 E甲基法尼酸酯( 2 E , 6 E methylfarnesoate ) 转化成 JH Ⅲ，起到了环氧化作用；并且该基因在咽侧体中表达变化还和保幼激素合成时间吻合，这些结果表明CYP15A1基因表达产物为保幼激素合成的环氧化酶。
由Halloween基因编码的五种细胞色素P450单加氧酶(cytochrome P450 monooxygenase, CYP)在多种昆虫中被证实与蜕皮激素的形成有关。其中CYP 307A1 (Spook)催化7脱氢胆甾醇转变为三脱氧蜕皮酮[3]，CYP 306A1（Phm）催化三脱氧蜕皮酮转化为二脱氧蜕皮酮，CYP 302A1（Dib）催化二脱氧蜕皮酮转化为2脱氧蜕皮酮，CYP 315A1（Sad）催化2脱氧蜕皮酮转化为蜕皮酮，最后在周缘组织中CYP 314A1（Shd）催化蜕皮酮转化为20羟基蜕皮酮。并且在最近的研究中[4]，成功的在灰飞虱体内克隆出这5个基因，并且证实与灰飞虱蜕皮激素的合成相关。本实验选取JHAMT、CYP15A1、CYP307A1、CYP306A1、CYP314A1五个基因，通过实时荧光定量PCR的方法测定了滞育与非滞育灰飞虱上述基因水平的差异，初步探索激素对灰飞虱滞育的分子调控，以期更加明确灰飞虱的滞育性质。
1 材料与方法
1.1 供试昆虫
实验供试灰飞虱（江苏姜堰种群）于2014年3月采自江苏姜堰市水稻田（32.51oN，120.15oE，）。采集的灰飞虱放入26±1℃、光周期LD16:8室内培养箱内（宁波江南仪器厂人工气候箱RXZ智能型）进行人工饲养。
1.2 滞育与非滞育灰飞虱目标基因龄期的特异性表达
滞育灰飞虱：温度20±1℃、光周期LD8:16条件下，随机选取25头4龄1、2、3、4、5、6、15、20、25、30、35、40、45天及5龄1天的灰飞虱若虫，用实时定量PCR检测滞育灰飞虱目标基因（JHAMT、CYP15A1、CYP307A1、CYP306A1、CYP314A1）表达量的变化。
非滞育灰飞虱：温度20±1℃、光周期LD=16:8条件下，随机选取25头4龄1、2、3、4、5、6天及5龄1天的灰飞虱若虫，用实时定量PCR检测非滞育灰飞虱目标基因（JHAMT、CYP15A1、CYP307A1、CYP306A1、CYP314A1）表达量的变化。
1.3实时荧光定量PCR
1.3.1实时荧光定量PCR引物设计
根据已知稻飞虱的JHAMT和Cyp15a1序列，运用Beacon Designer7软件设计PCR引物。内参基因选择ARF和RPL9[5]，实时定量PCR上下游引物设计。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法4
1.1 供试昆虫 4
1.2 滞育与非滞育灰飞虱目标基因龄期的特异性表达4
1.3 实时荧光定量PCR4
1.3.1实时荧光定量PCR引物设计4
1.3.2实时荧光定量PCR反应体系5
1.3.3灰飞虱目标基因表达量分析5
1.4数据统计方法6
2结果与分析6
2.1灰飞虱体内JHAMT和CYP15A1基因表达量的变化6
2.2 灰飞虱体内Halloween基因表达量的变化 7
2.3 灰飞虱体内不同基因表达量的变化与若虫蜕皮时间之间的关系 8
3讨论9
3.1 激素对灰飞虱滞育的调控9
致谢11
参考文献11
图1 滞育与非滞育灰飞虱不同天数（时间）靶基因JHAMT的相对表达量6
图2滞育与非滞育灰飞虱不同天数（时间）靶基因cyp15a1的相对表达量 7
图3滞育与非滞育灰飞虱不同天数（时间）靶基因cyp307a1的相对表达量7
图4滞育与非滞育灰飞虱不同天数（时间）靶基因cyp306a1的相对表达量8
图5滞育与非滞育灰飞虱不同天数（时间）靶基因cyp314a1的相对表达量8
图6 灰飞虱体内激素合成酶的表达量与若虫蜕
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
皮时间的关系9
表1 定量引物名称及序列5
滞育灰飞虱中激素合成酶基因的表达动态
引言
目前已知调控昆虫蜕皮与变态的激素主要有保幼激素(juvenilehormone, JH) 和蜕皮激素(molting hormone)两大类， 两者协同作用调控基因网络的级联反应和相互作用。蜕皮激素调控昆虫的蜕皮与变态，保幼激素抑制蜕皮激素调节的各种分子活动，控制昆虫的蜕皮。在幼虫取食期，保幼激素存在时，蜕皮激素启动幼虫不同龄期间的蜕皮；在变态期，保幼激素滴度降低或消失时，蜕皮激素启动变态蜕皮。
激素缺乏学说和保幼激素(JH)调节论，是两种对昆虫进入滞育的解释。激素缺乏学说用于解释蛹滞育的内分泌基础，其认为当幼虫大脑神经(NS)系统变为不活动、心侧体(CC)停止分泌促蜕皮激素时，昆虫便开始滞育；当心侧体重新开始释放促蜕皮激素后，幼虫形态变化才恢复。保幼激素调节论提出滞育幼虫与滞育蛹不同，咽侧体(CA)保持活跃分泌保幼激素，保幼激素通过调节蜕皮激素(MH)的分泌来诱导以及维持滞育。
保幼激素甲基转移酶（JHAMT）是保幼激素合成过程中重要的调控酶，它可以转移S 腺苷 L 蛋氨酸（SAM）中的一个甲基到保幼激素前体中，从而在咽侧体中产生有活性的保幼激素，研究发现果蝇发育过程中JHAMT的表达模式与保幼激素滴度的变化基本一致[1]。
Helvig等[2] 从太平洋折翅蠊 Diploptera punctata 咽侧体的 900 多条 ESTs 中拼接出一条P450基因序列，被命名为CYP15A1，该基因与果蝇的 P450 还原酶等组成重组酶系，能将2 E 6 E甲基法尼酸酯( 2 E , 6 E methylfarnesoate ) 转化成 JH Ⅲ，起到了环氧化作用；并且该基因在咽侧体中表达变化还和保幼激素合成时间吻合，这些结果表明CYP15A1基因表达产物为保幼激素合成的环氧化酶。
由Halloween基因编码的五种细胞色素P450单加氧酶(cytochrome P450 monooxygenase, CYP)在多种昆虫中被证实与蜕皮激素的形成有关。其中CYP 307A1 (Spook)催化7脱氢胆甾醇转变为三脱氧蜕皮酮[3]，CYP 306A1（Phm）催化三脱氧蜕皮酮转化为二脱氧蜕皮酮，CYP 302A1（Dib）催化二脱氧蜕皮酮转化为2脱氧蜕皮酮，CYP 315A1（Sad）催化2脱氧蜕皮酮转化为蜕皮酮，最后在周缘组织中CYP 314A1（Shd）催化蜕皮酮转化为20羟基蜕皮酮。并且在最近的研究中[4]，成功的在灰飞虱体内克隆出这5个基因，并且证实与灰飞虱蜕皮激素的合成相关。本实验选取JHAMT、CYP15A1、CYP307A1、CYP306A1、CYP314A1五个基因，通过实时荧光定量PCR的方法测定了滞育与非滞育灰飞虱上述基因水平的差异，初步探索激素对灰飞虱滞育的分子调控，以期更加明确灰飞虱的滞育性质。
1 材料与方法
1.1 供试昆虫
实验供试灰飞虱（江苏姜堰种群）于2014年3月采自江苏姜堰市水稻田（32.51oN，120.15oE，）。采集的灰飞虱放入26±1℃、光周期LD16:8室内培养箱内（宁波江南仪器厂人工气候箱RXZ智能型）进行人工饲养。
1.2 滞育与非滞育灰飞虱目标基因龄期的特异性表达
滞育灰飞虱：温度20±1℃、光周期LD8:16条件下，随机选取25头4龄1、2、3、4、5、6、15、20、25、30、35、40、45天及5龄1天的灰飞虱若虫，用实时定量PCR检测滞育灰飞虱目标基因（JHAMT、CYP15A1、CYP307A1、CYP306A1、CYP314A1）表达量的变化。
非滞育灰飞虱：温度20±1℃、光周期LD=16:8条件下，随机选取25头4龄1、2、3、4、5、6天及5龄1天的灰飞虱若虫，用实时定量PCR检测非滞育灰飞虱目标基因（JHAMT、CYP15A1、CYP307A1、CYP306A1、CYP314A1）表达量的变化。
1.3实时荧光定量PCR
1.3.1实时荧光定量PCR引物设计
根据已知稻飞虱的JHAMT和Cyp15a1序列，运用Beacon Designer7软件设计PCR引物。内参基因选择ARF和RPL9[5]，实时定量PCR上下游引物设计。
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